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专利名称:具有杀虫活性的蛋白的制作方法
技术领域:
本申请涉及一般控制有害有机体,更具体地说,组成成分和方法,控制方法和白蜡窄吉丁(‘ΑΒ的”),Agrilus曲柳窄吉丁。
背景技术:
苏云金杆菌(“Bt基因”)是一个孢子形成,杆状,革兰氏阳性菌密切相关,蜡样芽胞杆菌。大量的Bt基因已被发现并分离到亚种,分组,如苏云金芽孢杆菌苏云金杆菌,苏云金芽孢杆菌kurstaki,苏云金芽孢杆菌aizawai的基础上,分类计划最初由博纳富瓦,并在1963年开发德巴尔雅克等。转Bt显然是从其他杆菌区别在于细胞内晶体s,这是不溶性的蛋白生产中的存款,其中许多人对各种昆虫物种的杀虫活性。在芽孢形成过程中,综合了大量转Bt—个或几个蛋白S的然后晶体利泽成各种形状的。转Bt基因为基础的昆虫icides制定与孢子S和转Bt发酵过程中产生的材料,但主要的活性成分S是这些昆虫icidal蛋白晶体S作为第已知哭***哭了一个天然***毒性后,两者均致命剂量摄入通路涉及的易感主机1)由适当的PH值在中肠晶体***原增溶作用的结果;2)酶切割的***原分子在特定地点的活化形式的结果该***;3)活化***分子受体结合具体的刷状缘膜,导致肠上皮细胞裂解;
4)不可弥补的损害编队在肠道中肠细菌进入血腔造成的;及5)死亡败血症(Knowles和埃拉尔1992年,鲍尔和潘克拉茨1992年)。该基因编码的转Bt晶体蛋白被称为“哭,因为它的晶体-表型的生产”。第一次哭基因,后来被指定哭生长素,克隆约由施奈夫和怀特利(1981年,国立。Natl。ACAD的。科技。美国78个,2893年至2897年)20年前。从那时起,额外的cry基因的克隆许多报告已经出版。即使在一转Bt生产菌株的晶体蛋白在昆虫s品种特性不同。大多数转Bt晶体生产线昆虫icidal蛋白的角度衡量,鳞翅目物种活跃。此外,还有转Bt菌株产生晶体线昆虫icidal蛋白活火山对双翅目和鞘翅目昆虫物种。截至1997年,约190Bt基因为基础的微生物昆虫icides登记在美国的某些鳞翅目,双翅目控制和鞘翅目害虫fl(施奈夫等。1993年)。由于蛋白秒,转Bt的哭声基因用于赋予昆虫抗性植物和微生物秒使用基因工程在转Bt晶体蛋白,Cry3,Cry7,Cry8,Cry9和Cry43已知的对鞘翅目物种活跃。其中,CrySCa报道,对付圣甲虫甲虫活跃(大场等。,1992年,j的耳目一新。微生物。14,54-57)。在2003年,浅野等人。(2003年,生物防治28(2003),191-196)公布了一个新的转Bt菌株称为SDS502这显示了对鲳cuprea,甲侧柏,和非常高的水平弧丽金龟活动调查粳稻,这是圣甲虫甲虫物种。体育粳稻,日本甲虫,是在美国特别重要的基因高山口SDS502
粳稻活动负责已被隔离并命名crySDa。该基因编码的蛋白,CrySDa,发现有一高,对日本甲虫的具体活动,至少高一倍作为CrySCa和Cry43Aa,另外两个转Bt晶体蛋白S与具体活动对日本甲虫和其他金龟子杀虫活性。进一步资料SDS502,CrySDa,并CrySDa可能会发现在美国专利号6962977',发出2005年11月8日,这是此纳入参考的全部。在昆虫害虫的,任何已知的杀虫活性哭了先前发现,白蜡窄吉丁(EAB的),花曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科),可能是其中最具破坏性的。在白蜡窄吉丁是蛀木虫,原产于中国,日本,韩国,蒙古,俄罗斯远东地区,以及台湾(于1992年)。成虫从树上开始出现在5月底,在6月的高峰出现。在白蜡树叶完全刷新了这个时候。EAB的成虫比较长寿命(在实验室2个月)和灰树木的树叶在其整个生命。他们的日子大多是在花的檐篷,并要求饲养3周前的成熟开始产卵。有一些交错出现,因为EAB的发展在一或两年,这取决于对虫害的下降阶段,由于灰卫生早在侵扰他们需要2年时间攻击分行上层林冠削弱树。一旦冠下降是广泛的,他们攻击的主要干道和发展,是在一年内完成。2002年,被确定为EAB的广泛灰(白蜡属的原因。)在密歇根州和东南部附近的安大略省,加拿大死亡率。EAB的已造成约自其在北美(抵达Cappaert等2500万下密歇根州白蜡树。2005年,波兰和麦卡洛2006年)。EAB的也蔓延到美国密歇根州上半岛,俄亥俄,印第安纳州,马里兰州,弗吉尼亚州和伊利诺伊州。尽管州政府和联邦政府旨在遏制
EAB的,缺乏有效的方法来检测EAB的遍布树木和虫害面积隔离导致了监管机构从一个贫穷战略转变为管理1。在美国,EAB的根除努力涉及所有在周围白蜡树(美国农业部动植物检疫局2006年)著名虫害的Vi英里区搬迁。到被发现的感染和治疗时间,然而,EAB的了通常已经消灭这些外区分散。青铜桦木镗床,甲anxius,美国一个天然的EAB的相对已知传播在10至20英里的速度,每一年,这已被视为一个EAB的'自然扩散率(估计2003年提出的联邦登记册)。EAB的飞行和分散的格局最近的研究发现孕女性强制移民;一飞一女交配2公里,每天平均在4天飞行近10公里(泰勒等人。2006年)。除了自然扩散,蔓延的EAB的是加速通过人类辅助布满灰的木柴,木材,实木包装材料的运动,和苗木。这导致了EAB的蔓延从密歇根州的马里兰州和弗吉尼亚州在2003年;检疫遵守和执行仍然是一个问题。由于EAB的整个北美,管理机构,土地管理者和公众传播正在寻求诸如微生物和生物控制的可持续管理工具,以减少EAB的人口密度,减缓其传播(Cappaert等人。2005年,高2006年的报告,波兰和麦卡洛2006年,BenDor等。2006年)。EAB的带来的风险,在北美灰资源是巨大的。对粉煤灰的60种,白蜡属。全世界已知的16种天然到北美洲(哈克等人。2002年)。灰种北美特有的森林和已知的易受
EAB的包括白色灰(楼美洲),绿灰(楼permsylvanica),灰,黑(黑楼)树,是森林的重要组成部分;布卢阿什(楼quadrangulata)和南瓜灰(陈大良号),这是不太常见的物种。有越来越多的证据表明,EAB的攻击都将白蜡属。,虽然先天易感性的物种和品种而异(刘等人。2003年),魏等人。2004年,Rebek等。2005年,刘等人。印刷中)。每个白蜡属。适应是在森林生态系统略有不同的栖息地。几个品种的不良的场所和潮湿的土壤排水宽容,保护环境敏感的沿岸地区;如灰黑色的纯林生长在沼泽和沼泽中,他们提供浏览,热盖北部地区,保护野生动物,如鹿和驼鹿。在农业和防护林区,为牲畜提供了至关重要的灰住房;例如约25年的北达科他州所有的树木%是白蜡属。年轻的白蜡树的树皮,包括海狸,兔哺乳动物青睐食品,和豪猪;老树木提供诸如木材鸭,啄木鸟,山雀腔筑巢鸟类的栖息地,和红胸币鸟;种子消耗鸭,歌曲和游戏鸟类,小型哺乳动物和昆虫第根据最近美国农业部森林服务清单,有约80亿美元,(美国农业部2006年财政司司长)白蜡树。截至2006年,经理们估计25密歇根白蜡树万元屈服于EAB的。作者EAB的对林区生态环境的影响是难以量化或预测,%的林地平均有白蜡树属植物。(美国农业部财政司司长2006年)。阿什木材价值为需要强大的硬木材的应用,但刚性不足枫木。在美国东部,一个
114亿元的净灰板英尺锯木材采伐量,%。由不同国家的影响,但仅在密歇根州的木材灰估计为770亿板英尺收获一次。2001年,,球棒,家具,地板,集装箱,汽车和铁路联系,划艇桨,雪鞋,船,门,柜,是为灰绿色,如申请使用实木板条箱,盒,把手,并在生产高档纸纤维,黑色灰通常用于室内家具,橱柜,和天然的美国人需要为竹编艺术这一物种。除了制造业,白蜡树参与了城市景观,由于其历史抵抗害虫和不利的生长条件,如土壤板结和干旱,容忍了重要作用。许多灰树,现在街头,树荫服务和景观树木种植,以取代荷兰榆树病摧毁榆树,白蜡树现在包括5-20在整个北Ameri约所有街道树木%在美国,%的土地总面积,包含超过75%的人口,支持约38亿美元的树木。美国芝加哥市约603,000,(2003年联邦登记册)%白蜡树。树被认为是至关重要的,因为他们对城市的卫生隔离气态空气污染物及微粒物质,帮助人们透过树荫下保护他们提供能量,协助雨水分散,为城市群防护林带,并有助于审美快感生活的城市,居民和游客。阿什显然是城市森林的重要组成部分为经济和环境的潜在影响,如果这种木材无聊害虫的人,成为在美国成立,是广泛的。作者在美国的7553
万增长林地补偿价值白蜡树估计二千八百二十二亿五千万美元。现正研究开发EAB的管理工具,使用常规昆虫icides,然而,这些化合物大致毒性,价格昂贵,最有效的昆虫icides要求持牌施药处理,使他们在公园的使用,林地,森林,湿地和沿岸地区经济和环境不可接受(鲍尔等人。2005年)。对森林昆虫控制的主要管理工具登记微生物昆虫与昆虫病原细菌苏云金杆菌(Bt)的制定icides。公共飞播套用的转Bt基因为基础的微生物昆虫icides接受,主要用于在美国的吉普赛蛾的控制,是高,因为Bt基因是有效的,自然发生的,相对的主机具体的,可生物降解,生物控制,如兼容其他管理策略,并保留后,整个世界(麦卡洛和鲍尔2000年,西格尔2000)使用20年良好的安全记录。林业是其中的微生物昆虫icides已取代常规昆虫icides几个市场之一。这产生于对昆虫害虫舞毒蛾等森林管理Bt基因为基础的昆虫icides发展和云杉在60年代和70年代青虫。在20世纪80年代和90年代,包括发现和苏云金芽孢杆菌亚种的商业化技术发展。kurstaki高清我(Btk制剂),高效力的产品改进配方的稀释在超低量空中喷洒,和广泛的业务经验,导致在两落叶针叶林的管理和使用效益及环保标准昆虫icides森林食叶类群昆虫整个世界。1990年至1998年,Btk制剂应用于约四百五十〇万英亩(180万公顷)的落叶昆虫第林地管理后EAB的2002年发现,网络实名制注册评估了4
个转Bt对鳞翅目昆虫的控制方法icides活动和/或对鞘翅目害虫白蜡窄吉丁成虫fi。这些产品对EAB的证明无效,支持进一步研究需要确定一个EAB的积极转Bt菌株(鲍尔等人。2005年)。这涉及到一些克隆***及约30鞘翅目欧米茄积极转Bt菌株从美的文化和收藏品获得专利正在进行的EAB的成虫和幼虫生物测定。发明概述本公开包括能够产生毒性蛋白的微生物苏云金杆菌血清变型蜡螟SDS502菌株,所述毒性蛋白可以起到有害有机体控制剂的活性成分的作用,其对于白蜡窄吉丁(EAB)、花曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科)具有高特异性杀虫活性。本公开还证实衍生自SDS502菌株的下列材料都对EAB具有活性***原和***形式的CrySDa纯化蛋白、CrySDa晶体***和孢子混合物、和衍生自SDS502菌株的发酵液的发酵材料。本公开的另外的实施方案证实,当和分离自黄粉虫(鞘翅目拟步甲科)的钙黏着蛋白样蛋白混合时,SDS502材料对于昆虫害虫(包括EAB)的增强的杀虫活性。该肽rTmCadlp由来自黄粉虫的一部分Cry3Aa***粘结钙黏着蛋白(TmCadl)制成,当其和SDS502材料混合时,增加EAB的死亡率。本公开的另外的实施方案证实了液滴吸收生物测定法,其被开发以测定各种材料针对成年EAB的活性。附图简要说明
图1示出液滴吸收生物测定,其被开发以测定衍生自SDS502的各种材料对于成年EAB的活性。图2示出当两种形式的蛋白在
SDS-PAGE凝胶上运行时,Cry8Da***原和Cry8Da活化***之间的分子量差别。***原形式的蛋白的分子量为135KDa,而活化形式为约65KDa。图3示出CrySDa***原和CrySDa活化***对于成年EAB的生物测定结果,它们溶于50mMNaPO4缓冲液()中,***的96_h中间致死剂量(LD50)具有相对高的毒性。***原和活化***的类似毒性表示EAB中肠酶能够活化该***。变性CrySDa******剂量的EAB成虫没有毒性,所述***通过在50mMCAPS缓冲液(pH10)中煮沸20分钟而变性,而所有EAB成虫在接受类似剂量的非变性Cry8Da***72h内死亡。这证实在我们的生物测定中EAB成虫死亡率由SDS502Cry8Da蛋白引起,其是首先证实对于EAB具有毒性的Cry***。评价CrySDa对于EAB幼虫的毒性的生物测定同样证实对于幼年形式的EAB的杀虫活性。图4示出SDS502孢子和晶体的混合物。白色箭头指向包含CrySDa***的晶。更大的椭圆形目标为孢子。图5示出针对成年EAB测试时,多种孢子_蛋白***晶体混合物的死亡率%,包括15种不同菌株的Bt和它们的相对毒性对成年EAB至SDS502孢子-晶体混合物。Bt培养物在DSMG培养基中在振荡水浴培养下生长,晶体/孢子以27,OOOg旋转,并使用无菌DiH20和NaCl在20,OOOg下洗涤,重悬于无菌DiH20中,超声,稀释液负载到SDSPAGE上,并且使用凝胶
Doc利用比重计测定的蛋白浓度和作为标准曲线的BSA相关联。图6示出SDS502天然孢子-晶体混合物对于成年EAB的中间致死剂量(LD50)。,其是使用已知浓度的CrySDa***冻干的粉末。该粉末混悬于DiH20中,,,,***,使用DiH20作为对照。对于6个处理/生物测定,十五个EAB被单独给药,重复两次生物测定,用SASProcProbit分析。图7示出在给予各种浓度的SDS502天然孢子-晶体混合物后的天数内,成年EAB
累积死亡率%。图8示出将白蜡树叶浸渍到混悬于Silwet中的SDS502原粉中后,在叶浸渍测定中的成年EAB死亡率%。图9示出当混合或不混合钙黏着蛋白样蛋白时,纯化CrySDa***对于成年EAB的相对毒性的生物测定结果,肽rTmCadlp由分离自黄粉虫(鞘翅目拟步甲科)的一部分钙黏着蛋白TmCadl制成。
)的一部分Cry3Aa***粘结钙黏着蛋白制成的肽rTmCadlp,其包括预测的***粘结区域。TmCadl肽片段对应于全长蛋白(核苷酸4,076-4,661的翻译)的氨基酸残基1,322-1,516。黑体和下划线表示TmCadl氨基酸(195个残基),而氨基酸末端处的37个残基来自