文档介绍：基因敲除
i (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。
图1. RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统
2. 应用CRISPR /Cas9提供模式生物靶向基因技术服务,包括小鼠,大鼠,斑马鱼等;
近几十年来,随着全基因组测序技术的不断成熟,我们在各种细菌和古细菌(archaea)中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列
(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,即CRISPR序列,这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列)和CRISPR相关基因
(CRISPR-associated genes, Cas gene)。研究发现,这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的,说明这套
CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制,就好像是另外一套适应性免疫反应系统
(adaptive immune system)。后续的遗传学试验和生物化学试验也证实了这种猜测。
虽然有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与,但是在很多细菌
的胞内都只需要一种内切酶(endonuclease)——Cas9就足够了,我
们将这种CRISPR–Cas系统也称作2型系统(type II systems),如图1所示。Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割,不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序(proto-spacer adjacent motifs,PAM基序)。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体,还需要另外两个RNA分子的帮助,它们就是CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA
(trans -acting CRISPR RNA, tracrRNA)。不过最近有研究发现,这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA
(single-guide RNA, sgRNA)。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。最新的报道称,在多种类型的细胞和生物体内,这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使功能,在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进行后续的基因组改造工作了。细胞通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复,这两种方式分别是同源重组修复机制
(homologous bination, HR)和非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining, NHEJ),不过在修复的过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰,或者插入新的遗传信息。◆YORK/文
Cas 9系统作用于人类细胞
一直以来,在向导RNA的指引下,Cas 9内切酶能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割,不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序(PAM基序)。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体,还需要CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA(tracrRNA)这两个RNA分子的帮助。