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基因敲除技术与生物制药
Gene knock out skill and bio-pharmaceuticals
基因敲除技术与生物制药
基因敲除是将基因组中特定的一个基因去除、替换或灭活, 然后从细胞水平或整体观察该基因的功能。
基因靶向、基因打靶、基因中断技术、基因剔除
2007年诺贝尔医学与生理学奖,是现代生物学研究
热点中的热点。
Gene knock out skill and bio-pharmaceuticals
具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA 共同稳定遗传的特点。
常规基因工程与基因敲除的区别;
内切酶和连接酶联合使用可以实现“基因敲除”;
同源重组与基因敲除的关系;
纠正人体缺陷基因一直是人类的梦想。
原核生物的Red系统
Exo:结合在DNA双链末端,5’→3’降解单链。
1. 基因敲除技术的常见种类
Red重组系统的结构
三个基因编码三个蛋白:Exo、 Beta、Gam
Beta蛋白:紧紧地结合在单链DNA3′突出端,
防止DNA 被单链核酸酶降解,
介导互补单链DNA 的退火,引发重组。
Gam蛋白:与宿主的RecBCD复合体结合、抑制宿主
外切核酸酶活性,阻止外源线性DNA片
段被降。
Exo蛋白
3’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
Beta蛋白
3’
Red重组系统的种类
Wanner重组系统:将 Exo、 Beta、Gam整合到细菌
质粒中。主要有 pkd20和pKd46两种质粒。
Court重组系统:将 Exo、 Beta、Gam整合到细菌的
染色体中。
Red重组的机理
Exo蛋白
5’
3’
3’
5’
3’
5’
Beta蛋白
3’
5’
3’
5’
被敲除和替换的区段
Red重组的实验方案
第二步,诱导宿主细胞表达Exo、Bata和Gam 蛋白,并制备成感受态细胞,然后与PCR 扩增获得的线性DNA 片段混和电转化;
(Court重组为例)
第一步, PCR合成被敲除基因的同源片段,寡核苷酸的5′端有30~50bp与靶基因末端同源, 3′端有20bp 与靶基因的末端同源;
第三步,线性PCR产物与宿主靶基因的同源序列发生替换,完成重组。
Court重组为例的原理
Red重组技术的先进性
因此大大地简化了操作步骤,得到了广泛应用。
Red重组技术需要的同源臂只有36~50bp ,
利用线性DNA即可实现同源重组,
不需要克隆到打靶质粒,
只需一次同源重组即可实现基因敲除。
小鼠Cre-LoxP系统
Cre:重组酶,专门设别LoxP位点。
LoxP:34个碱基,左侧13个碱基与右侧13个碱基反
向互补,中间8个碱基为间隔序列。
ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
ATAACTTCGTATA
TATTGAAGCATAT
来自E. coli 噬菌体P1 的cre 基因编码,Cre重组酶有70%的重组效率,不借助任何辅助因子,作用于多种结构的DNA底物,如线形、环状,甚至超螺旋。
Cre-LoxP系统结构
该系统由重组酶Cre基因和LoxP核苷酸序列组成。