文档介绍：基因敲除技术
摘要:基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。
关键字:基因敲除;Cre/LoxP系统;基因载体;生物模型
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基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法,是功能基因组学研究的重要研究工具。是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。
基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。
2000年Shimizu等于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的[
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利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为:
细胞的获得:现在基因敲除一般应用于鼠,而最常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉
瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用,最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。c57BL/6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域,并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。
:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因,TK基因等)的载体上,此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同,此载体有不同的设计方法,可分为替换性载体和插入型载体。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上,这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。如为了使某一基因失去其生理功能,这时所要设计的替换型打靶载体,
应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。 (常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中,使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。一般地,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但便于使用。
:一般地,筛选使用正、负选择法,比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞,然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞,剩下的细胞为命中的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中,再将此囊胚植人假孕母鼠体内,使其发育成嵌合体小鼠。
,达到研究目的基因的目的。
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. 利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初,胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年,首次证实的哺乳动物细胞中