文档介绍：基因组DNA亚硫酸氢盐处理
第一部分基因组DNA的提取。
DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节:
1:蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;
2:RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二:
1:紫外分光光度计计算OD比值;
2:1%-%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水(DDW)均经高压蒸汽灭菌。
1:;
2: NaOH;
3: 42℃水浴30min;
水浴期间配制:
4:10mM对苯二酚(氢醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)
5: (Sigma,S9000),配制方法:,并以3M NaOH滴定溶液至PH ,最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。。加520ul至上述水浴后溶液中。
6:EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液。
7:加200 ul石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化。
8:50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适。
这一步细节:
1:基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug。
2:所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确。
3:亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,,否则PH不合适会影响后续纯化吸收。 4:水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。
第三部分修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,。
2:以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统(Promega,A7280)
1)70℃水浴预热DDW;配制80%异丙醇;
2)加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合;
3)由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便;如果没有,需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内