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专利名称:作为药剂的细胞若丁s衍生物的制备及其应用方法
本发明与细胞若丁S衍生物,特别是细胞若丁S-免疫球蛋白复合物有关。
该发明的细胞若丁S衍生物有选择性地作用于癌细胞,是一种有用的抗癌剂。
据报道,培养链霉菌Y-11472(-2658)生产的细胞若丁混合物原液,通过酸处理可以制备细胞若丁S,它具有抗癌活性(日本专利Laid-open60-48994)。虽然细胞若丁S本身已具有相当高的抗癌活性,人们还是期望得到有选择性的作用于癌细胞并有很高生物可利用价值的药物。
由于细胞若丁S衍生物的广泛研究(在对癌细胞有选择的特异性方面的研究是出色的),我们已经成功地得到细胞若丁S-免疫球蛋白复合物,它仍保持细胞若丁S本身的抗癌活性。在上述发现的基础上,该发明已经实现。
按照本发明,这里提供细胞若丁S衍生物及其制备方法,连同含有细胞若丁S衍生物的抗癌剂如下1)细胞若丁S衍生物的化学结构通式如(I)。
式中的X代表下列基团,如-NH2,-NH-R1-NH2,-NH-R1-COOH,-NH-R1-SH,
在上列基团中,R1代表二价烃基,它可以被任一取代物取代,
R2二价烃基,R3表二价有机基团,IgG代表免疫球蛋白的一部分,n代表1~15及其盐的整体。
2)按照1),细胞若丁S衍生物中R3可以是R1,或都是下列基团。
或
式中R4代表二价烃基。
3)按照上述条款2),细胞若丁S衍生物中R2是丙烯基,R4是亚***。
4)按照上述条款1)~3),细胞若丁S衍生物中的n是5~12。
5)按照上述1)~4)条款,细胞若丁S衍生物中的IgG是癌胚抗原(CEA)抗体的一部分。
6)制备细胞若丁S衍生物的方法中,其化学结构通式中(I)的X代表下列基团-NH2,-NH-R1-NH2,
或
上式中R1代表二烃基,它可以被任一取代基取代。R2表二价烃基,R3代表二价有机基团。IgG代表免疫球蛋白的一部分,n代表含由还原细胞若丁S的1~15个整体。一个细胞若丁S化学结构见(II)
在铵盐或含NH2-R1-NH2化合物(R1意义同上)存在的条件下,用碱金属的氢硼***化物,细胞若丁S被还原,得到细胞若丁S衍生物,在上述化学结构式(I)中,X是-NH或-NH2-R1-NH2。如果必要,产物与马来酰亚***化合物(结构式如III)反应,
(结构式中R2意义同上)产生的细胞若丁S衍生物(I),其X是
或
下一步,如果必要,产物与巯基化的免疫球蛋白(化学结构式IV)起反应,产生细胞若丁S衍生物(I),其X代表
在(IV)式中,R4代表二价烃基,IgG意义同上,n′代表1~20个的整体。
7)按照上述条款6),在细胞若丁S衍生物的制备方法中,R3是
或
8)在通式(I)的细胞若丁S衍生物的制备方法中,X代表-NH-R1-SH或
,其中R3表可被任一取代物取代的二价烃基,R2表二价烃基,IgG代表免疫球蛋白的一部分,n代表1~15个的整体。它是由还原的细胞若丁S组成。在含有NH2-R1-SH基团(R1意义同上)的化合物存在的条件下,利用碱金属的氢硼***化物还原上述(II)中的细胞若丁S,得到(I)中的细胞若丁S衍生物,在上述结构式(I)中的X是-NH-R1-SH,而且如果必要,产物与马来酰亚***化的免疫球蛋白(结构式见V)
起反应,产生(I)式中的细胞若丁S衍生物,其中X为
在(V)中,R2和LgG意义同上,n代表1~20个的整体。
9)按照条款8)制备细胞若丁S衍生物的方法中,R3是
10)在制备通式(I)的细胞若丁S衍生物方法中,X代表-NH-R1-COOH或
,式中R1代表可以被某一取代物取代的二价烃基,R2代表二价有机基团,IgG代表免疫球蛋白的一部分,n代表1~15个整体,它包含有还原性细胞若丁S,在NH2-R1-COOH化合物(R1意义同上)存在的条件下,细胞若丁S,与碱金属氢硼***化物起反应,得到还原的细胞若丁S结构如上述(II),如果必要,产物与一种免疫蛋白(结构式如VI,NH2(IgG)1/n(VI),其中IgG意义同上,n代表1~15个整体)反应,产生(I)结构式中的细胞若丁S衍生物,其中(I)中的X为
11)按照10),制备细胞若丁S衍生物的方法中R3为R1。
12)抗癌剂中含有细胞若丁S衍生物,其化学结构式如(I)。
。
-免疫球蛋白复合物和细胞若丁S的洗脱图形。柱色层分离法。
-免疫球蛋白的紫外光谱。
-免疫球蛋白复合物对L1210细胞的抑制细胞生长的活性。
,细胞若丁S-MA204免疫复合物,细胞若丁S兔免疫球蛋白复合物和防治colo205细胞的抑制细胞生长的活性。
-免疫球蛋白复合物和aclacinomycin免疫球蛋白复合物对L1210细胞的抑制细胞生长的活性。
已经提到,在上述的化学通式(I)中,R1的优先的例子是从已知的α-氨基酸,β-,γ-和ε-氨基酸以及β-,γ-和ε-硫***中衍生来的基团。
已经提到,在上述化学通式(I)中,R2的优先例子是较低的亚烃基,如亚***,亚乙基,和亚丙基,次苯基如对-次苯基和间-次苯基,C4~C7的环亚烃基如次环己基,次苯基的低烃基如***次苯基,C4~C7的环状烯基的低烃苯如***环己烯基。已经提到,R3优先的例子是
R4优先的例子是低次烃基,如次***,次乙基和次丙基,次苯基如对一次苯基,间-次苯基,C4~C7的环状次烃基如环次己基,次苯基的低烃基如***次苯基,C4~C7环状次烃基的低烃基如***环次己基。以IgG所代表的免疫球蛋白的一部分指的是有几个氨基已从一个免疫球蛋白中除去。通式(I)的IgG包含有若干硫醇基
,即被引入到免疫球蛋白的若干硫醇基仍然存在。这是因为,在硫醇化的免疫球蛋白(IV)中,不是所有的硫醇基都与细胞若丁S的衍生物起反应,其中有一些硫醇基扔然是无反应的。
作为免疫球蛋白一部分是优先的抗体,它与癌细胞有特异性结合。
1/n指的是每个细胞若丁S分子中所含免疫球蛋白分子的数目,其范围是1/1到1/15。即有1~15个分子的细胞若丁S与一分子的免疫球蛋白相结合。
在通式(1)所代表的一个化合物中,其X是-NH2,-NH-R1-NH2,-NHR1-COOH,-NHR1-SH,
通式(I)中所代表的化合物是制备免疫球蛋白复合物的中间化合物,当然,它保留有细胞若丁S的抗癌活性,实际上,也可以作为一种抗癌剂。
在生产抗癌剂和免疫球蛋白之间的复合体过程中,一般地说,借助于双功能交链试剂、冷凝剂或间隔剂,抗癌剂可以与免疫球蛋白结合。让抗癌剂与双功能交链试剂、冷凝剂或间隔剂相化合,通过上述的官能团(如氨基,羧基或硫醇基)已经成功的生产上述物质。然而,由于细胞若丁S根本没有这些功能团,因此为了制备含有氨基,羧基或硫醇基的衍生物、细胞若丁S在化学上必需改变。为了生产细胞若丁S的衍生物而又不丧失其抗癌活性,糖链上的氧基可以被改变成氨基。还原氧基的一般方法包括利用氢铝化锂(LiAlH),氢硼化钠(NaBH)或其它类似物。可以用来有选择性的还原糖链上氧基,而不还原蒽环灵环(Anthracyclinring)上的氧基的化学试剂是氢***硼化锂(LiBCNH3)。在铵盐或含有氨基的有机化合物存在的条件下,利用还原剂LiBCNH3时,糖链上的氧基有选择的被还原成氨基,因此,生产出细胞若丁
S的衍生物。实际上,具有化学结构式(II)的细胞若丁S变成了细胞若丁S衍生物(I)。
在细胞若丁S的衍生物(I)中,由于在铵盐或含氨基的有机化合物(如含有NH2-R1-NH2,NH2-R1-COOH,或NH2-R1-SH)的条件下,用碱金属氢***硼化物还原,(I)结构中的X是-NH2或-NH-R1-NH2,-NH-R1-COOH,-NHR1-SH。
铵盐的例子包括醋酸铵,丙酸铵和***化铵。含有氨基的有机化合物的例子已知的有α-氨基酸,如赖氨酸、半胱氨酸,β-,γ-和ε-氨基酸,如γ-氨基丁酸,氨基酸酯如甘氨酸乙酯,硫醇***如氨基乙硫醇,氨基噻吩。碱金属氢***硼化物包括氢***硼化锂(或钠)。
上述反应容易进行,其反应条件是把细胞若丁S和铵盐或含氨基酸的有机化合物溶入到可混水的有机溶剂中(如甲醇或乙醇)或溶入到不含一级***和二级***的缓冲液(如磷酸缓冲液硼酸缓冲液或2,4,6三***盐酸吡啶缓冲液),,然后,溶液中加入碱金属的氢***化物,在室温或在冰冷却下。
反应混合物中的产物可以用简便的方法回收。,用适当的有机溶剂提取(如二***甲烷),从提取液中蒸馏出溶剂或借助于制备高压液相色谱仪回收产物。
当细胞若丁S衍生物中为-NH2或-NH-R1-NH2时,细胞若丁S的氨基衍生物再与具有上述化学结构(III)的马来酰亚***(顺丁烯二酰亚***
)化合物反应,生成具有结构(I)中的细胞若丁S衍生物,其中X为
和
所形成的付产品是N-羟基琥珀酰亚***。所说的马来酰亚***化合物(III)的一个实例是N-γ-马来酰亚***丁酰氧琥珀酰亚***〔GMBS,R2(CH2)3〕,琥珀酰亚***基4-(正-***马来酰亚***基)-环己烃羟基化合物(
),琥珀酰亚***基4-(邻-马来酰亚***亚***苯基)丁基化合物(
)和偏-马来酰亚***苯基-正-羟基琥珀酰亚***脂(
)。
上述反应可以容易地进行。其反应条件是用马来酰亚***化合物溶于适当溶剂(如二***甲烷,二***乙烷,***仿、吡啶、三乙***等)中,在室温下或冰冷却下处理细胞若丁S的氨基衍生物。
马来酰亚***引入到细胞若丁S后所得到的细胞若丁S衍生物能够忍受与某些含硫醇基的蛋白质和化合物加成反应。马来酰亚***基的双键与硫醇基一起加了亲电子的加成反应。如下所述,马来酰亚***基和引入到免疫蛋白上的硫醇基之间的加成反应能够形成一种复合物。
一般地,用于制备复合物的免疫球蛋白优选的是单克隆抗体,它对癌细胞形成的膜蛋白质有特异性。在临床应用非人源抗体时也是期望着使用除去Fc片断的抗体。然而,考虑到效率,除了细胞若丁
S外,所有抗体都采用。
所谓特别优先的免疫球蛋白是单克隆抗体,它是癌特异蛋白如癌胚抗原(CEA)或α-胎蛋白(AFP)的抗体。癌胚抗原的单克隆抗体的简易制备方法是用抗原处理白鼠,取白鼠脾,利用聚乙烯乙二醇法让脾细胞与HAT-敏感的骨髓瘤细胞融合,然后,利用HAT介质作为选择性介质挑选杂交癌瘤,并植入白鼠体内。
为了制备复合物,在免疫球蛋白与带有马来酰亚***基的细胞若丁S起反应之前,流醇基就引入到免疫球蛋白上。为了引入硫醇基,免疫球蛋白与-琥珀酰亚***化合物(通式见(VII)
起反应,产生一种硫醇基化的免疫球蛋白(结构式见上述(IV))。在(VII)结构式中,R4意义同上,R5硫醇基的保护基,如酰基(如酰基)和2-硫吡啶基。
所谓正-琥珀酰亚***化合物(VII)的优先例子是正-琥珀酰亚***基-硫-乙酰基硫代醋酸盐
SATA与免疫球蛋白中的氨基反应形成酰***键
在酰***键中,硫醇基被乙酰基保护起来。其付产品是正-羟基琥珀酰亚***。硫醇基的去保护是利用羟***,,上述酰***键的结构就转化成反应基
在某些条件下,硫醇基易被氧化,结果就形成免疫球蛋白的多聚体。因此,就希望在25℃下乙酰基去保护处理约一个小时,然后就立即与带有马来酰亚***基的细胞若丁S衍生物起反应。
硫醇基被引导的比例是每个免疫球蛋白分子引导1~20个基团,其优势的是5~20基团,它决定于所使用的SATA的量。引导作用不招致免疫球蛋白抗体活性的丧失。
利用N-琥珀酰亚***3-(2-硫代吡啶基)丙酸酯
作为硫醇基导入剂取代SATA,利用二硫苏醣醇作为去保护剂与免疫球蛋白中的氨基一起形成
这样产生的带有硫醇基的免疫球蛋白与带有马来酰亚***的细胞若丁S反应,按照本发明,制备出免疫球蛋白的复合体(IV)。
上面的反应可以容易的进行,其反应条件是把带有马来酰亚***基的细胞若丁S衍生物的混水有机溶剂(如甲醇、乙醇、二甲替甲酰***)溶液与带有硫醇基的免疫球蛋白水溶液混匀,)。
引入硫醇基的细胞若丁S衍生物(其X为-NH-R1-SH)能够忍受与蛋白质或引入马来酰亚***基化合物的加成反应。通过亲电子加成反应,马来酰亚***的双键与硫醇基反应。因此,如下所述,通过把硫醇基加到带有马来酰亚***的免疫球蛋白的马来酰亚***基上形成了复合物。
被用来制备复合物的免疫球蛋白如上所述。
免疫球蛋白与带有硫醇基的细胞若丁S起反应之前,马来酰亚***就已引入到免疫球蛋白与马来酰亚***基(结构式如