体外细胞培养和移植试剂盒的制作方法.docx

文档介绍：该【体外细胞培养和移植试剂盒的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【20】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【体外细胞培养和移植试剂盒的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。体外细胞培养和移植试剂盒的制作方法
专利名称:体外细胞培养和移植试剂盒的制作方法
技术领域:
本发明涉及细胞选择和扩增技术,更具体地,涉及体外细胞培养和移植试剂盒。发明背景细胞减少疗法涉及采用电离辐射和化学***来杀死迅速分裂的细胞。由于对正常细胞的细胞毒性作用而带来的典型副作用限制了细胞减少疗法的应用。常见的副作用是骨髓抑制,或者损害产生红细胞、白细胞和血小板的骨髓细胞。而骨髓抑制的结果,将使病人得血细胞减少症,或血细胞缺乏,这些会增加感染和出血疾病的风险。血细胞减少症会增加发病率及死亡率,并导致在癌症治疗中的低剂量服药。另一方面,高剂量的化学疗法在治疗上是有益的,因为与标准剂量的疗法相比较,它可以提高患转移癌症尤其是乳腺癌病人的目标应答频率。它可使一些甚至预后不良病人长期无病缓解。然而,高剂量的化学疗法具有毒性,很多会导致与感染、出血疾病、及其它与长期骨髓再生障碍相关影响等有关的临床并发症。
许多临床研究者已经设计了各种细胞减少疗法的剂量方案和计划来增加癌症治疗的服药量,同时又可以限制其对骨髓的损害。另一种方法是利用这样一个事实血细胞来自造血干细胞,而这些干细胞定向分化成不同的谱系,即红细胞系的、巨核细胞的、粒细胞的、单核细胞和淋巴细胞。因此,在用细胞减少疗法治疗癌症病人中,针对这些干细胞的细胞分
离十分感兴趣。一种疗法涉及骨髓或外周血细胞移植,在该方法中,在细胞减少治疗之前,收集骨髓或循环系统中的造血祖细胞或干细胞并通过细胞培养而繁殖。接着在治疗后将扩增的细胞群再输入以恢复完整的造血功能。任选地,可以使用选择步骤以增加收集的外植体中造血祖细胞的相对数目。通过再输入分离的干细胞或祖细胞,可以大大减少将其他类型的细胞(包括恶性细胞)再输入的机会。此外,在同种异体移植过程中,通过仅选择干细胞或祖细胞可大大减少移植的T细胞的数目,从而降低引发病人患移植物抗宿主病(Graft-versus-HostDisease,GvHD)的可能性。
已知有各种细胞选择技术可在一群细胞中鉴别和分离出造血干细胞或祖细胞。用于鉴别和选择这些细胞类型的方法和材料是已知的。例如,可用单克隆抗体与干细胞或祖细胞上发现的标记蛋白或表面抗原蛋白结合。造血干细胞的这类标记物或细胞表面抗原包括CD34,My-10和Thy-1。在一种方法中,将抗体固定于某一表面如玻璃珠表面,然后与可能含有干细胞的细胞混合物接触。这使抗体可结合并将干细胞固定于玻璃珠。或者,可将抗体和细胞混合物一起孵育,将形成的共混物与对抗体-细胞复合物具有亲和性的表面进行接触。将不需要的细胞和细胞物质去除,得到较纯的干细胞群。具有CD34标记物的干细胞占骨髓中单核细胞的约1-3%。
CD34+干细胞在外周血中数量比在骨髓中低约10-100倍。因此,为了减少从骨髓或外周血中获得的所需干细胞的数目,需要具有增加或扩增分离的干细胞数目的方法,以便在高剂量的放射或化学治疗后使骨髓快速而完全地恢复。
另一种细胞选择方法涉及用某种抗代谢物(antimetabolite)去除分裂细胞。通过将细胞因子刺激和抗代谢物处理两者结合起来,可在应答细胞中诱发细胞死亡。因此,抗细胞因子增殖效应的细胞被阳性选择出。参见Beradi等人,Sci-ence,267104(1995)。
使用扩增的干细胞还允许在不能获得足量干细胞的情况下进行移植。一种被称为体外干细胞培养和移植(ESCCAT)的程序,也称为回体(exvivo)扩增,通常涉及从外周血、骨髓或脐带血中获取自体或同种异体干细胞,分离出干细胞,然后体外扩增这些细胞。在扩增之后,将细胞输入病人。发明概述本发明涉及细胞选择和扩增技术,尤其是体外细胞培养和移植(ESCCAT)。更具体地,本发明涉及体外细胞培养和移植试剂盒,该试剂盒含有,但并不限于在从人体获得的细胞混合物中选择具有所需表现型的细胞的装置;从混合物分离选择的细胞的装置;孵育分离细胞的装置;含有有效量的细胞扩增因子的组合物,其中扩增因子选自GM-CSF、G-CSF、IL-1、IL-3、IL-6、TPO、EPO、flt3-配体、SF和GM-SCF/IL-3融合蛋白;以及细胞生长培养基。在试剂盒中,分离装置用于接受细胞混合物和选择装置,并用于从混合物中分离所需细胞。此外,孵育装置用于接受来自分离装置的分离细胞、细胞生长培养基和扩增因子组合物,并进一步用于使细胞扩增因子与分离细胞充分接触,从而发生细胞扩增
。
任选地,本发明的试剂盒可含有容器,以盛装从人体收集来的细胞混合物,其中该容器用于接受收集的细胞,有时还可接受选择装置。
本发明的试剂盒提供了大量的细胞扩增因子,这些因子在ESCCAT中用于刺激能自我更新的干细胞增殖以及谱系定向(lineage-committed)的祖细胞的增殖和分化。这些细胞生长因子包括白细胞介素1和3(分别为IL-1和IL-3)、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSFs)、GM-CSF和IL-3的分子融合蛋白(PIXY321)、flt3-配体和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。其他血细胞生长因子包括干细胞因子(SF)(也称为c-kit配体、肥大细胞生长因子和钢因子)、血小板生成素、红细胞生成素(EPO)和IL-6。这些因子可用于促进分离的干细胞和祖细胞的体外扩增。
本发明的试剂盒可用于选择和扩增具有所需表现型的任何细胞群。例如,该试剂盒可用于造血干细胞和祖细胞的扩增和移植、T细胞或B细胞的扩增和移植,以及基因治疗。发明的详细描述本发明涉及细胞选择和扩增技术,尤其是体外细胞培养和移植。如此处所述,本发明包括一种ESCCAT试剂盒,它含有
1)在细胞混合物中选择具有所需表现型的细胞的装置;2)从混合物中分离选择的细胞的装置;3)孵育分离细胞的装置;4)含有有效量的细胞扩增因子的组合物,其中扩增因子选自GM-CSF、G-CSF、,IL-1、IL-3、IL-6、TPO、EPO、flt3-配体、SF和GM-SCF/IL-3融合蛋白;以及5)细胞生长培养基。
可设计任选的容器,以便最初接受收集的细胞,有时还可接受选择装置。分离装置用于接受直接来自病人或来自任选的容器的细胞混合物和选择装置。分离装置还用于从混合物中分离选择出的细胞。孵育装置用于接受来自分离装置的分离细胞、细胞生长培养基和扩增因子组合物,并进一步用于使细胞扩增因子与分离细胞充分接触以诱发分离细胞的扩增。
可从各种来源收集细胞混合物。对于选择造血干细胞或祖细胞,一般是从包括骨髓、外周血或脐带血在内的来源收集细胞。定义术语“干细胞”和“祖细胞”指多潜能的早期谱系细胞。与本领域中一般****惯相同,在本文中这两个术语可互换使用。术语“干细胞或祖细胞”指或者干细胞、或祖细胞,或者干细胞和祖细胞的混合物。如本领域中通常使用的那样,干细胞和祖细胞一般可用下列细胞特征进行鉴别CD34+,CD33-,CD38-,Thy-1+和My-10+。
此处所用的术语“flt3-L”是指在祖细胞和干细胞中所发现的能够与flt3受体独立结合或复合的一类多肽。术语“flt3-L”
还包含EP-A627487中所述的蛋白质,该专利在此引用作为参考。术语“flt3-L”包含具有EP-A627487中氨基酸顺序SFQIDNO6的1至235的蛋白质,以及与该蛋白质具有高度相似性或高度同一性的、具有生物活性并可结合flt3受体的蛋白质。并且,此术语指EP-A627,487中序列SEQIDNO5的DNA的具有生物活性的基因产物。术语“flt3-L”更进一步包括膜结合蛋白质(包括胞内区域、跨膜区域和胞外区域),以及基本含有蛋白质的胞外部分、保留生物活性并能被分泌的可溶性或被截短的蛋白质。这类可溶性蛋白质的特殊例子是在EP-A627,487中具有氨基酸顺序SEQIDNO6的28至160的蛋白质。
术语“IL-1”指IL-1a和IL-1β中任何一个或两个(Marchetal.,Na-ture,315641,1985)。IL-1α和IL-1β都能与IL-1受体(I型和II型)结合。前体和成熟形式的IL-1α都有活性,而IL-1β只有在成熟形式下才有活性(Marchetal.,同上)。术语“IL-1”也指活性片段和具有不同氨基酸序列的类似物和衍生物如具有IL-1组份和IL-1生物活性的融合蛋白,参见Mosleyetal.,,Sci844572(1987)。
术语“IL-3”,108,910中所述的一组白细胞介素3多肽,该专利在此引用作为参考。这些多肽包括氨基酸序列与天然的人白细胞介素3的氨基酸序列(例如在欧洲专利出版物
,598和282,185中公开的,这些文献在此引用作为参考)基本相似的类似物。术语“IL-3”还包括具有至少某些与天然人IL-3相同生物活性的IL-3分子的类似物和等位基因。IL-,185。其他形式的IL-3包括人IL-3[Pro8Asp15Asp70]、人IL-3[Ser8Asp15Asp70]和人IL-3[Ser8]。编码适用于本发明的人IL-3蛋白质的DNA序列可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)公开获得,索引号为ATCC67747。此处所用的括号中的氨基酸序列的有关术语是用于指出与天然人的蛋白质不同的氨基酸。例如,人IL-3[Ser8Asp15Asp70]指8位氨基酸变为丝氨酸残基,15位氨基酸变为天冬氨酸残基以及70位氨基酸变为天冬氨酸残基的人IL-3蛋白。
术语“IL-6”指在PCT出版物WO88/O0206、EP257406和EP-A331,640中所述的一组蛋白质,这些专利在此引用作为参考。IL-6与“干扰素-β2”(Zilbersteinetal.,EMBOJ.,52529(1986))及“可在人成纤维细胞中诱导的26KD蛋白质”(Haegemanetal.,.,159625(1986))是相同的。这些蛋白质包括氨基酸序列与天然的人白细胞介素6的氨基酸序列基本相同的、具有生物活性(可结合IL-6受体、通过结合IL-6受体而引发生物信号的转换、或与抗IL-6抗体交叉反应)的类似物。IL-6的核苷酸序列和推导的氨基酸序列已经公开,例如在
WO88/00206中。术语“IL-6”还包括足以保留天然人IL-6的生物活性的天然人IL-6分子的类似物。
如本文所用,“GM-CSF”,108,910和5,229,496中所述的一组蛋白质,这些专利在此引用作为参考。这些蛋白质包括氨基酸序列与天然人GM-CSF的氨基酸序列(例如公开获得的ATCC53157或ATCC39900)基本相同的、具有生物活性(可结合GM-CFS受体或与抗GM-CSF抗体交叉反应)的类似物。氨基酸序列已经公开,例如在Anderson,etal.,.,USA826250(1985)中。市售的GM-CSF(sargramostim)可从ImmunexCorp.,Seattle,WA处获得。术语“GM-CSF”还包括足以保留天然人GM-CSF的生物活性的天然人GM-CSF分子的类似物。GM-,这些专利在此引用作为参考。GM-CSF的其他类似物还可用于构建与IL-3的融合蛋白。编码特别优选的、潜在糖基化位点被去除的GM-CSF蛋白的DNA序列可从ATCC公开获得,索引号为ATCC67231。
术语“GM-CSF/IL-3融合蛋白”指GM-CSF和IL-3的C末端与N末端融合的融合蛋白。融合蛋白是已知的,,199,942、5,108,910和5,073,627中有所描述,这些专利在此引用作为参考。优选的融合蛋白是在美国专利
,199,942中描述的PIXY321。
术语“基本相似(或类似)”指变异体氨基酸序列较佳地与天然氨基酸序列有至少80%相同,最佳至少90%相同。同源性的百分比可通过比较顺序资料加以确定,例如使用Devereux等人(,1984),此程序可从威斯康辛大学遗传学计算机组(UnivesityofWiscousinGeneticsComputerGroup(UWGCG))得到。GAP程序使用了经Smith和Waterman(,1981)修订过的Needleman和Wunsch(,1970)的排列方法。对于GAP程序较好的缺省参数包括(1)对核苷酸的一元比较矩阵(包含数值1指同一和数值0指非同一),以及如Schwartz和Dayhoff所描述的Gribskov-Burgess(,1986)的加权比较矩阵(AtlasofProteinSequenceandStruc-ture,NationalBiomedicalResearchFoundation,-358,1979);(2),;(3)对末端缺隙没有罚分。变异体可以包含保守替换顺序,这指一个氨基酸残基被一个具有相似的物理化学性质的氨基酸残基所替换。保守替换的例子包括用一个脂肪族氨基酸替换另一个。例如用异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸间相互替换;或用一个极性氨基酸替换另一个,如赖氨酸和精氨酸之间,谷氨酸和天
冬氨酸之间以及谷氨酰***和天冬酰***之间的替换。其他这类保守性替换是已知的,例如,具有相似疏水性的整个区域的替换。本发明也包括天然产生的细胞扩增因子的变异体。这类变异体的例子有由于交替的mRNA剪接作用造成的或由于天然蛋白的蛋白酶解作用而得到的蛋白质,其中生物活性仍保留。
术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽,例如重组宿主细胞培养物的纯化产物或纯化的抽提物。
术语“自体移植”指将所需表现型的细胞从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
术语“异体移植”指将所需表现型的细胞从某病人中取出并再施用于另一不同病人的方法。术语“同基因移植”指在遗传上相同的人之间发生的细胞移植。
如本文所用,术语“扩增”指提高、增加、或丰富具有所需表现型的细胞的数目。
术语“ESCCAT”指这样一种方法,它包括(1)从人体收集具有所需表现型的细胞;(2)用含有有效量细胞扩增生长因子的组合物扩增回体细胞,从而提供所需细胞的数目增加的细胞制剂;和(3)结合细胞减少治疗或在细胞减少治疗之后,将细胞制剂给病人施用。