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专利名称:以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法及其应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及医药,特别是一种以碳纳米材料为载体的PH敏感型药物传递系统的制备方法及其应用。
背景技术:
近年来碳纳米材料在作为药物载体上的应用越来越广泛。在纳米材料中,包括富勒烯、碳纳米管和氧化石墨烯在内的碳纳米材料一直是近年来国际科学的前沿领域之一。碳纳米管(CNTs)以其独特的电学、力学、光学和热力学性质引起了各学科的广泛关注。巨大的比表面积(2600m2/g)、超高的机械强度、较低的密度、出众的化学和热稳定性和富电子等特性、独特的跨膜能力以及大离域η键,可以与许多生物医药分子之间形成较强的
键相互作用,使其在生物医药领域具有巨大的应用潜力。碳纳米管用作药物载体,主要是利用其细胞穿透能力,携带目标生物活性分子进入细胞。CNTs可以有效携带蛋白质、抗体、多肽、药物和核酸等生物活性物质进入细胞,从而成为人们关注的载体。生物系统对7001,IOOnm范围的近红外光具有高度透过性,而SWNTs在此范围内具有高吸收的特性,可以利用
SWNTs在此范围内的光热转换特性对肿瘤进行激光热疗。将SWNTs肿瘤靶向给药系统和激光热疗联合应用可以达到更加有效的抗肿瘤作用。富勒烯以其独特的结构和性质倍受人们重视,近十年来,几乎全世界所有著名大学和研究所的科学家都进行了与富勒烯有关的研究。它已成为当今物理、化学、材料及生命科学研究者共同关心的课题。富勒烯分子的重要科学意义,被美国《Science》杂志评为1991年的“明星分子”。近年来,富勒烯在生物医药领域的研究相当引人瞩目,研究发现富勒烯具有多种特殊的生物学效应:(I)可抑制多种酶的活性,包括HIV蛋白酶以及逆转录酶;(2)对肿瘤细胞显示出细胞毒性;(3)具有神经保护剂的作用;(4)还具有在可见光照射下产生氧自由基、切割DNA的作用。富勒烯作为一种优良的光敏剂表现在其在可见光照射的情况下可以产生活性氧,活性氧包括单线态氧、超氧负离子等,可以表现出明显的细胞毒性,比如裂解细胞中的DNA,抑制细胞的有丝分裂以及生长,还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。富勒烯作为光敏剂可以用于肿瘤的治疗。富勒烯作为一种优良的光敏剂表现在其在可见光照射的情况下可以产生活性氧,活性氧包括单线态氧、超氧负离子等。富勒烯光照下产生活性氧为高度反应性的,并且可以表现出明显的细胞毒性,比如裂解细胞中的DNA,抑制细胞的有丝分裂以及生长,还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。由此推断,富勒烯可以用于肿瘤的治疗。为此利用富勒烯作为光敏剂开展光动力疗法,即使其在肿瘤组织中蓄积,利用光照产生活性氧来选择性的破坏肿瘤组织。近年
来氧化石墨烯的研究在全世界科学家的共同努力下取得了巨大进展。氧化石墨烯表面由于存在大量的含氧官能团,表面呈现为极性,因而亲水性较强,另外由于这些官能团的存在使得大量的SP2杂化的碳原子转化为SP3杂化的碳原子,从而使大量的分子,特别是那些具备一定功能性的有机小分子都可以通过化学反应接枝到氧化石墨烯的表面上。又由于氧化石墨烯是单原子层结构,比表面积大,非常适合做药物载体。据报道,氧化石墨烯也具有良好的热性能。通过腙键连接含羰基的抗肿瘤药物,pH敏感的机理主要是利用腙键的不稳定性,在pH小于6时腙键断裂,鉴于一些肿瘤组织局部缺血时,肿瘤间质液会出现异常酸化现象及pH比正常组织低的事实,因而通过腙键连接的药物能够有效释放在酸性的肿瘤微环境中,从而发挥抗肿瘤作用。目前将碳纳米材料通过修饰与抗肿瘤药物形成腙键,从而构建以碳纳米材料为载体的PH敏感型药物传递系统,及其作为光敏剂和热敏剂和药物转运载体在肿瘤治疗中的应用尚未见报道,因此,本发明的研制成功具有统计学上的意义和实际的临床意义。
发明内容
针对上述情况,为解决现有技术之缺陷,本发明之目的就是提供一种以碳纳米材料为载体的
PH敏感型药物传递系统的制备方法及其应用,可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大,不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。本发明解决的技术方案是,对原始的碳纳米材料进行修饰,与氨化试剂反应,将碳纳米材料表面连接上反应活性的氨基后,再与对羧基苯肼反应,生成碳纳米材料的对羧基苯肼衍生物,然后与含羰基的抗肿瘤药物反应得到以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统,在该以碳纳米材料为载体的PH敏感型药物传递系统中,-:1;所述的碳纳米材料为富勒烯、碳纳米管、氧化石墨稀。以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法:
I)“一种水溶性富勒烯及其应用”中说出的方法进行氨基化修饰;
2)将上述含氨基的富勒烯50mg、对羧基苯肼(HBA)40mg和1-乙基-(3-二***氨基丙基)碳二亚***盐酸盐(EDC-HCDlOOmg和N-羟基琥珀酰亚***(NHS)60mg在20ml磷酸盐缓冲液(PBS)中混合均匀,在室温下,400r/min搅拌24h使其充分反应,加入无水乙醇或***50-100mL,静置2h,***乙烯微孔滤膜抽滤,重复操作5_10次,在20-60°C真空干燥24-56h,得到富勒烯的对羧基苯肼衍生物;
3)将上述得到的富勒烯的对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二***亚砜(DMSO)中混合均匀,在室温下,400r/min搅拌24_48h使其充分反应,经无水乙醇沉淀后,再用甲醇或二***甲烷或水洗净后,在20-60°C真空干燥24-56h,得到以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统;所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸卩比柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物。以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法:
I)将碳纳米管110-120mg加入体积比为3:I的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的***组成的混酸溶液40mL中,再加入10_15ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在功率为300400W的超声波清洗器中超声Ih后,用超纯水稀释,,并不断用超纯水冲洗至pH=7,放入烘箱中80°C恒温干燥,得羧基化的碳纳米管;
2)将上述羧基化的碳纳米管45-50mg加入20mL氨化试剂,再加入IgN,N’-二环己基碳二亚***,超声分散IOmin后,放入油浴锅中,在120°C、100r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,,用无水乙醇洗去多余的N,N’-二环己基碳二亚***、乙二***以及其他的副产物,在40-80°C下,真空干燥
24-56h,得氨基化的碳纳米管;所述的氨化试剂为乙二***、1,3-丙二***、1,6-己二***中的一种;
3)将上述氨基化的碳纳米管50mg、对羧基苯肼(HBA)40mg和1-乙基-(3-二***氨基丙基)碳二亚***盐酸盐(EDC-HCl)IOOmg和N-羟基琥珀酰亚***(NHS)60mg在20mL磷酸盐缓冲液(PBS)中混合均匀,室温下,400r/min搅拌24h;使其充分反应,经无水乙醇或***50-100mL洗净后,静置2h,***乙烯微孔滤膜抽滤,如此重复操作5_10次,在20-60°C真空干燥24-56h,得到碳纳米管对羧基苯肼衍生物。4)将上述得到的碳纳米管对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二***亚砜(DMSO)中混合均匀,室温下,400r/min避光搅拌24h使其充分反应,经无水乙醇沉淀后,再用溶剂A洗净,在20-60°C真空干燥24-56h,得到以碳纳米管为载体的PH敏感型药物传递系统;所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种;所述的溶剂A为甲醇、二***甲烷和水中的一种或两种以上的混合物。以氧化石墨烯为载体的药物传递系统的制备方法:
O将氧化石墨烯50mg加入体积比为3:I的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的***组成的混酸溶液120mL中,再加入4_12mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液,在超声功率为
300400W的超声波清洗器中超声Ih后,用超纯水稀释,,并不断用超纯水冲洗至PH为中性为止,放入烘箱中80°C恒温干燥,即得羧基化的氧化石墨烯;
2)将上述羧基化的氧化石墨烯50mg加入20mL氨化试剂,再加入IgN,N’-二环己基碳二亚***,超声分散IOmin后,放入油浴锅中,在120°C、100r/min下搅拌,冷凝回流48h,反应结束后,将反应物冷却至室温,用无水乙醇洗去多余的N,N’-二环己基碳二亚***、乙二***以及其他的副产物,***乙烯微孔滤膜和布氏漏斗过滤10遍,在40-80°C真空干燥24-56h,即得到氨基化的氧化石墨烯;所述的氨化试剂为乙二***、1,3-丙二***、1,6-己二***中的一种;
3)将上述氨基化的氧化石墨烯50mg、对羧基苯肼(HBA)40mg和1-乙基-(3-二***氨基丙基)碳二亚***盐酸盐(EDC-HCDlOOmg和N-羟基琥珀酰亚***(NHS)60mg在20mL磷酸盐缓冲液(PBS)中混合均匀,室温下,400r/min搅拌24h使其充分反应,加入无水乙醇或***50-100mL,静置2h,***乙烯微孔滤膜抽滤,如此重复操作5_10次,在20-60°C真空干燥24-56h,得到氧化石墨烯对羧基苯肼衍生物;
4)将上述得到的氧化石墨烯对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物
40mg在20mL二***亚砜(DMSO)中混合均匀,室温下,400r/min避光搅拌24h使其充分反应,经无水乙醇沉淀后,再经甲醇、二***甲烷和水逐次洗涤,在20-60°C真空干燥24-56h,得到以氧化石墨烯为载体的PH敏感型药物传递系统;所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸卩比柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物。以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为光敏剂在肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分:
I)将制得的以富勒烯为载体的PH敏感型药物传递系统溶于水中制成溶液加入到癌细胞A中进行培养,给药后3h后用光源B光照,光照30-120min,继续培养24小时,测定癌细胞A的存活率。2)将制得的以富勒烯为载体的PH敏感型药物传递系统溶于水中制成溶液,静脉注射到荷瘤小鼠C体内,给药后3h后用光源D光照,光照时间为30-120min,测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。上述步骤I中的癌细胞A为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤,肺癌,鼻咽癌,食道癌,胃癌,肝癌,大肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,白血病,胰腺癌,宫颈癌,喉癌,甲状腺癌,舌癌,脑瘤(颅内肿瘤),小肠肿瘤,胆囊癌,胆管癌,肾癌,前列腺癌,***癌,睾丸肿瘤,子宫内膜癌,绒毛膜癌,***恶性肿瘤,***恶性肿瘤,霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤,皮肤癌,恶性黑色素瘤中的一种。上述步骤
I中的光源B为:400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。上述步骤2中的荷瘤小鼠C为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤,肺癌,鼻咽癌,食道癌,胃癌,肝癌,大肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,白血病,胰腺癌,宫颈癌,喉癌,甲状腺癌,舌癌,脑瘤(颅内肿瘤),小肠肿瘤,胆囊癌,胆管癌,肾癌,前列腺癌,***癌,睾丸肿瘤,子宫内膜癌,绒毛膜癌,***恶性肿瘤,***恶性肿瘤,霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤,皮肤癌,恶性黑色素瘤中的一种。上述步骤2中的光源D为:400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。本发明的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为光敏剂来进行光动力治疗体内深度肿瘤时,这些光源不能够穿透照射时,可以通过适用与所述部位的方法来改善外部光源照射的穿透力进行肿瘤的治疗。本发明的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为光敏剂可以制成任意的药物制剂剂型,比如:注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的以富勒烯为载体的PH敏感型药物传递系统可以加入各种制剂的添加剂,比如:生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为:静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为热敏剂在肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分
:
I)将制得的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的PH敏感型药物传递系统溶于水中制成溶液,加入到癌细胞A中进行培养,给药后3h后用光源B光照,光照l_5min,继续培养24小时,测定癌细胞A的存活率。2)将制得的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统溶于水中制成溶液,静脉注射到荷瘤小鼠C体内,给药后3h后用光源D光照,光照时间为l_5min,测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。上述步骤I中的癌细胞A为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤,肺癌,鼻咽癌,食道癌,胃癌,肝癌,大肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,白血病,胰腺癌,宫颈癌,喉癌,甲状腺癌,舌癌,脑瘤(颅内肿瘤),小肠肿瘤,胆囊癌,胆管癌,肾癌,前列腺癌,***癌,睾丸肿瘤,子宫内膜癌,绒毛膜癌,***恶性肿瘤,***恶性肿瘤,霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤,皮肤癌,恶性黑色素瘤中的一种。上述步骤I中的光源B为:780-1IOOnm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选808nm激光。上述步骤2中的荷瘤小鼠C为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤,肺癌,鼻咽癌,食道癌,胃癌,肝癌,大肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,白血病,胰腺癌,宫颈癌,喉癌,甲状腺癌,舌癌,脑瘤(颅内肿瘤),小肠肿瘤,胆囊癌,胆管癌,肾癌,前列腺癌,***癌,睾丸肿瘤,子宫内膜癌,绒毛膜癌,***恶性肿瘤,***恶性肿瘤,霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤,皮肤癌,恶性黑色素瘤中的一种。上述步骤