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专利名称:从血液特别是外周血扩增成体干细胞的方法及在医药领域的相关应用的制作方法
从血液特别是外周血扩增成体干细胞的方法及在医药领域的相关应用
本发明涉及从成年哺乳动物血液,尤其但不仅限于从外周血扩增干细胞的方法及在医药领域(特别是在兽医领域)用于治疗损害、慢性和/或急性炎症性病症、神经学的和神经变性的病症的相关应用。
在本说明书的此处及下文,以及如在文献中所已知的,词汇"扩增"是指或者通过细胞分裂,或着如在本发明所公开和要求保护的特定情况下通过"去分化"增加细胞数目的方法,即,正如下文将要看到的,通过其存在于血液中的细胞经过合适的体外处理后转化成干细胞的方法。
近年来,由于在治疗先前被认为不能治愈的多种病症中取得了成功,干细胞的治疗应用已经获得巨大的认可。然而,截止目前,已知的获取干细胞的方法仍然费力且花费巨大。
多能干细胞(PSC)是可用的来源,其不仅用于研究,也用于创制药物和移植(,2002;,2002)。
有两大类干细胞一胚胎干细胞和成体干细胞第一类来源于胚胎,更
确切地来源于8日龄的胚泡,与此相反,成体干细胞主要能从骨髓、脂肪、肌肉组织或外周血获取。
干细胞的定义不断在更新,目前,没有分离或鉴别干细胞的普遍一致的意见或标准方法。对于所有这些胚胎干细胞(ES)和成体干细胞(造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC))(,2003),已经鉴定了不同的遗传标记,其中某些标记对许多细胞类型是共有的(,2006;KangW,丄等人,2006;,2003;,1976)。
特另'j地,Zhao等人既在论文"爿pmj^em/6tood
//!Owoc^fe-^fer/vedsw6sC""5"fl51//"n》0fe/^ste附ce〃s,,("人夕卜周血单核细胞来源的亚型充当多能干细胞,,)也在WO2004/043990中公开了制备羊核细胞来源的干细胞的方法,其包括下述步骤分离外周血单核细胞,将它与促有丝分裂的成分接触,然后在适于该细胞增殖的条件下培养外周血单核细胞。
该方法首先需要分离单核细胞的步骤,其次需要在培养基中的扩增步骤,为获取显著数目的干细胞,该方法需要15-20天的非常长的时间,并且不能获取全能型干细胞,全能型干细胞是非特异的、适于从第一次提取起在非常短时间内直接注射给患者的干细胞。
很多科学工作描述了干细胞再生不同类型损害、再生由机械损伤的或由多种病症损伤的组织、从
^f艮本上消除产生损伤的原因而不是简单地作用于其效应上的能力。
目前,研究被更多地导向于使用分离自胚胎组织、胎儿或脐带的干细胞,但这引起了各种法律问题和伦理问题。最重要的是,时至今日,这些细胞的使用带来了各种禁忌征,如感染的风险、移植时的排斥风险以及在马类中发生畸胎瘤。
因此,为避免这些问题,人们想到在"体内"治疗中优选使用分离自骨髓、脂肪组织或外周血的自体干细胞。这些从成体干细胞开始用起的方法提供了利用特定分化诱导因子在"体外"(或"离体")分化干细胞为目标细胞系的步骤,以及随后的将获取的分化细胞系"体内"移植的步骤。在这些方法中,限制归因于下述事实由于再引入患者体内的分化细胞不被识别为自身细胞,发生可观察到的排斥现象,这是由于在体外诱导的分化步骤中,它们丧失了自身识别的因子。
在人类中,从外周血中获取干细胞必须需要通过一个称为"单采血液成分术,,或"白细胞单采血液成分术"的方法纯化它们。在实践中,从血液提取和收集细胞,然后在化疗或放疗后立即将其注射入患者。在单^ii液成分术中,其持续6到8小时,从臂部静脉或颈部静脉或胸部静脉抽取血液,并4吏血液流过用于移除干细胞的机器。将由此纯化的血液输回患者,而收集的细胞利用液氮冷冻进行保藏(,2006;KangW丄等人,2006)。该技术不仅令患者疼痛,也令患者感到极度的压力。此外,它对于小型动物或大型动物也不适用;
最重要的是,该技术未提供对循环系统中干细胞的真正辨别和/或纯化。
目前,在兽医科学领域,干细胞主要在有损伤的肌腱和韧带的重建中得到成功应用。主要的纯化技术如下
一使用生长因子或血小板衍生物(TGF-B,VEGF),但提取这些物质的经济费用贵不可攀(,2006);
一分离取自骨髓的干细胞。该技术仅能将包含在提取的物质中的15%的细胞进行纯化并将其用于治疗;
一分离取自脂肪组织的干细胞。该技术需要从供体动物预先外科手术去除大量组织,且不允许静脉给药;
—称作Tendotrophin的IGF-1(胰岛素样生长因子1)(Fiedler丄等人,2006);
一UBM(膀胱基质)这是来源于猪的含有细胞因子的衍生物(但不是有核细胞),其诱导伤口的瘢痕形成而不是损伤区域的再生(,2005)。
考虑到上面所有的因素,显然需要从容易取得的来源扩增和纯化成体干细胞的方法,其也必须能够获得适于用作医学-兽医领域药物的干细胞,一旦给药哺乳动物,该干细胞不引起排斥现象且易于保存。
显然也需要获得多能干细胞和全能型干细胞(即非特异性的),能将其直接注射给患者,且具有比目前提供的那些短得多的生产时间。
现在,本发明的发明人改善了从外周血体外扩增和纯化干细胞的方法,以能够获得干细胞,该干细胞不引起副作用,如排斥现象、感染、畸胎瘤,一旦给药于成年哺乳动物,其能"体内,,分化并且表现为多能干细胞。
本发明人观察到,根据治疗的动物的需求和病症,如此扩增的细胞一旦被局部或静脉注射,就在"体内,,(不是在"体外,,,如在本领域现状
2003;,等人,2002;,2005))获得了巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞和肝细胞的所有形态特征和化学特征。本方法比截止目前使用的收集干细胞的其他方法具有更小的侵入性、无痛(如与单采血液成分术相比较)、经济并且在技术上最适用于所有动物物种(小型动物和大型动物)。
最后,容易地获取这些细胞以及之后能够在液氮冷冻下长时间保藏它们的可能性,使得根据本发明的方法获取的细胞适于自体移植,以用于治疗许多人类和兽医病症(各种类型的损害、代谢病、急性和慢性神经学的和炎症性病症)或用于改善某些动物如马的竟争性能。
因此,本发明特别涉及一种从血液,特别是但不仅限于外周血扩增成体干细胞的方法,其包含下述步骤。
第一个步骤包括两个子步骤
a)血液,特别是但不仅限于外周血的干细胞的第一个扩增子步骤,利用浓度为8-15nM优选10nM的MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)的体外处理在采集干细胞后立即进行;根据进行体外处理的条件,扩增步骤可能具有可变的持续时间,发明人已经通过实验证实,用MCSF体外处理的持续时间在24-96小时之间,优选在48-72小时之间,导致扩增的稳定,通过标记CD卯、CD34和混合的CD卯/CD34的同时存在可确认。该条件被认为是最佳的一个条件。
术语"立即,,是指从细胞提取到开始体外处理之间可能的最短时间,在任何情况下其不超过10分钟,有利地,不超过5分钟。
b)在第一个子步骤之后是纯化的第二子步骤,优选通过菲克梯度分级分离。
该纯化步骤从根本上讲旨在破坏红细胞并在平板上培养巨噬细胞和单核细胞。
因此,与本领域现状相反,本发明提供了首先通过将细胞与MCSF和
可能的抗凝血剂接触(例如在合适的试管中)扩增细胞的步骤;该扩增步
骤在血细胞从患者提取后立即进行,而未分离其特定部分且未使用任何培养基。在纯化步骤后提供另一个步骤
c)在步骤b)中纯化的血液,特别是但不仅限于外周血的干细胞的进一步扩增,其使用浓度为
35-55nM,优选50nM,更优选45nM的MCSF
进行体外处理。
该步骤也可能具有24-96小时、优选48-72小时的可变持续时间。据观察,在使用浓度超过55nM(即70nM)的MCSF24小时后,细胞不保持多能千细胞的表型(请参见附
图12)。具体地,先前的在取血后立即使用MCSF在悬浮液中的扩增步骤a)允许增加涉及单核细胞和巨噬细胞群的干细胞的百分比(请参见附图13)。随后的步骤允许获得多能干细胞,该多能干细胞在体内直接分化而不导致排斥现象或感染。
治疗损害的药物中的用途。可治疗的损害选自哺乳动物皮肤损害、腱损害、韧带损害、骨损害、粘膜损害或骨折。
神经学的或神经变性病症的药物中的用途,所述病症选自库欣病、摇头病、Wobbler氏综合征、呼吸困难、肢体轻瘫;急性或慢性炎性病症,其选自蹄叶炎、骨膜炎、胃炎、关节病、以及由病毒、细菌、寄生虫和真菌性媒介导致的炎症;哺乳动物胃膨胀扭转。
本发明也涉及根据本发明的方法获得的干细胞在治疗母马不育、小马早熟和提高哺乳动物竟争性能中的用途。本发明也涉及包含作为活性成分的,根据上述扩增方法获得的成体干细胞以及可药用佐剂和/或赋形剂的药物纟且合物。
根据一个特别优选的具体实施方案,根据上面公开的方法获得的用作活性成分的成体干细胞以90-250x103个细胞/1111,优选150x1(P个细胞/ml的浓度与可药用佐剂和/或赋形剂共同存在于组合物中,所述組合物配制为用于静脉注射的形式。
根据另一个具体实施方案,根据上面定义的扩增方法获得的,用作活性成分的成体干细胞以4-40x106个细胞/ml的浓度与可药用佐剂和/或赋形剂共同存在于组合物中,所述组合物配制为用于局部施用(在外伤的情况下也称为局部应用)的形式。
根据本发明的一个特别优选的具体实施方案,上述药物组合物也能包
含作为活性成分的抗生素,其浓度为5-15nM,优选10nM。优选地,所述抗生素是庆大霉素或阿米卡星(amicacin)。
本发明也涉及上述药物组合物(即适用于局部施用的,含或不含抗生素)作为治疗损害的药物的用途,所述损害选自哺乳动物的皮肤损害、腱损害、韧带损害、骨损害、粘膜损害。
根据另一个特点,本发明涉及上述药物组合物(即适用于局部施用的,含或不含抗生素)作为治疗哺乳动物骨折的药物的用途。
本发明也涉及上述药物组合物(即适用于静脉注射给药的)作为治疗神经学的或神经变性病症的药物的用途,所述病症包括哺乳动物的库欣病、摇头病、
Wobbler氏综合征、呼吸困难、肢体轻瘫。
才艮据另一个具体实施方案,本发明涉及上述药物组合物(即适用于静脉注射给药的)作为治疗急性或慢性炎性病症的药物的用途,所述病症选自哺乳动物的蹄叶炎、骨膜炎、胃炎、关节炎、以及由病毒、细菌、寄生虫和真菌性媒介导致的炎症。
本发明也涉及上述药物組合物(即适用于静脉给药的)作为治疗哺乳动物胃膨胀扭曲综合征的药物的用途。根据本发明的药物组合物在胆嚢病症、心血管病症、具有继发抑郁的应激、繁殖、母马不育、小马早熟及提
高动物竟争活力中也有用。
在本发明的优选具体实施方案中,在医学领域的用途优选应用于兽医领域,治疗的哺乳动物选自马、犬、猫或人。
现在,本发明将通过特别参考附图,以其优选具体实施方案中的非限制性实施例形式公开,其中
图1:显示了母马后跗节和第一趾骨间含有梭状芽孢杆菌和伸肌腱破坏的20cm损害;
图2:显示了局部应用根据本发明的千细胞三个月后图1的相同母马;图3:显示了治疗六个月后的母马;
图4:显示了具有80。/。表面屈肌腱损害的马的超声波扫描;图5:显示了用根据本发明的干细胞局部治疗大约3个半月后的马的超声波扫描;
图6:显示了用干细胞局部治疗大约3个半月后马的超声波扫描;
图7:显示了局部治疗大约4个月后马的超声波扫描;注意腱几乎完
全再生且缺少瘢痕组织;
图8:显示了具有较小实体(直径小于lcm)的腱损害的母马的超声
波扫描;
图9:显示了局部治疗一个月后图7的相同母马的超声波扫描;图10:显示了用本发明的干细胞治疗前的患有全身无力、因疝气而进行过手术的17岁龄的马;
图11:显示了静脉注射本发明的干细胞治疗1年后17岁龄马的性能;图12:显示了用不同数量MCSF处理来自外周血的经分离培养的细胞的复制15nM(具有叉的虛线)、25nM(具有三角形的虛线,顶点向下);35nM(具有三角形的虛线,顶点向上);50nM(具有黑圆圏的虛线),60nM(具有白色方块的虚线),70nM(具有白圆圏的虛线);结果是三份外周血样计数的细胞的平均值;
图13:显示了来自外周血的经分离培养的细胞的复制用MCSF预处理(具有黑点的折线),未用MCSF处理(具有叉的折线);结果是三份