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专利名称:从包膜病毒中回收酶活性的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种从包膜病毒中回收酶活性的方法,例如测定包装于包膜病毒中的酶。所述方法特别开发用于除包膜病毒外还含有非保护性酶的生物样品。
背景在这一领域中一个传统问题实例是在细胞抽提物或细胞培养液中测定逆转录病毒的逆转录酶(RT)时遇到的。在逆转录期间RT产生病毒RNA的DNA拷贝。常规的RT活性测定通过利用一个人造的模板-引物结构和氚化的三磷酸脱氧核苷酸作为核苷酸底物来完成。该模板/引物对多聚(rA)/寡聚(dT)是最有效和最多使用的组合来测定HIV和其它逆转录病毒的RT(Baltimore-71,Lee等人-87)。早期已认识到一些细胞DNA聚合酶使得这类依靠产生可测量的产物数量的测定系统的结果不明确。
在真核细胞中已鉴别出至少9种不同类型的DNA聚合酶。聚合酶α在细胞分裂期间负责DNA的复制,聚合酶β是涉及DNA修复的主要聚合酶,聚合酶λ负责线粒体中的DNA合成。每种细胞聚合酶以不同的形式出现并与不同的蛋白结合。它们的酶特性随它们的分子形式和细胞类型来源不同而不同(参见评论Hübscher等人2000)。此外,细胞可以包含来自感染病毒或编码病毒DNA聚合酶的内源病毒基因的酶。细胞
DNA聚合酶中,DNA聚合酶α最少倾向于利用prA作模板,但是有某些分子类型的这种酶可以有效拷贝prA(Goulian&Grimm1990,Yoshida等人1981)。
实际上不同的聚合酶在定量逆转录病毒RT时,存在特异性问题。围绕这一问题的许多方法可以在文献中看到。最显而易见的方法是分离病毒与细胞蛋白质。各种方法如离心法或病毒体吸附到特异性受体或抗体上在这种情况均有使用。当纯化材料包含大量的细胞组分和微量病毒时存在的一个普遍问题是不能排除同时纯化的少量细胞聚合酶。此外,从应用角度来看,用比较麻烦的分离步骤处理大量样品是没有吸引力的。
另一种方法是设计同工酶特异性酶测定条件来或多或少从检测中排除细胞聚合酶,如λ聚合酶。这可以通过使用抑制剂、交替金属离子或模板/引物对来完成。例如众所周知聚(2’-O-***-rC)n寡聚(dG)12-18是逆转录病毒RT的高特异性底物。然而经这种方法获得的增强特异性通常受到酶反应速度相应降低和随后对需要检测的酶的灵敏度降低的限制。
我们近来开发了一种用于定量感染人群血浆样品中的HIVRT的方法。该方法基于病毒结合到一种具有固定化离子交换剂的凝胶上。抗体和干扰物质经冲洗去除而具有酶活性的RT通过用非离子去污剂裂解固定化病毒回收(Gatu等人2000)。回收的
RT量用基于预先用odT固定化prA的一种灵敏RT测定来最终定量。当用这个系统处理来自健康血液捐献者的对照血浆时,我们发现了纯化组分中的少量RT活性。
进一步研究发现来自健康人的天然EDTA血浆包含比较大量的RT活性,RT活性还主要存在于提取自相同类型样品的淋巴细胞组分提取物。这种未分类的酶的一些性质描述于表1。在“病毒固定化”后用我们的分离系统回收的活性量小于血浆总活性的千分之一,但足以使少量HIVRT的检测不明确。
发明详述本发明针对上文揭示的具体问题提供一种解决方案,但它也普遍适用于检测包膜病毒包含的所有的酶。包膜病毒家族以及该家族中一些在人类传播的包膜病毒的实例包括痘病毒科病毒(如牛痘和天花)、虹彩病毒科疱疹病毒科(如单纯疱疹病毒、水痘病毒、细胞巨化病毒和Eppstein-Barr病毒)、披膜病毒科(如黄热病毒、蜱传(thick-borne)脑炎病毒、风疹病毒和热带脑炎病毒)、冠状病毒科(如人冠状病毒)、副粘病毒科(如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸合胞体病毒)、弹状病毒科(Rabdoviridae)(如水泡性口膜炎病毒和狂犬病病毒)、纤丝病毒科(如马尔堡病毒和埃博拉病毒)、正粘病毒科(如流感A和B病毒)、本扬病毒科(Bunyaviridae)(如Bwamba病毒、加利福尼亚脑炎病毒、白蛉热病毒和里夫特山谷热病毒)、沙粒样病毒科(如LCM病毒、拉沙热病毒和Juni病毒)、肝脱氧核糖核酸病毒科(如乙型肝炎病毒
)、逆转录病毒科(如HTLV和HIV)。
本发明方法基于使用修饰蛋白的化学物质来破坏非保护性的溶解酶活性,即游离酶以及与例如蛋白质、细胞成分或细胞器结合但不受病毒包膜保护的酶。化学物质穿透病毒包膜的能力与它的疏水性有关。如果病毒包膜对选定的化学物质产生保护,那么有可能去除或者灭活活性化学物质,裂解病毒体并定量释放的病毒酶活性量。有许多具有或多或少位点特异性的试剂可用于蛋白修饰(见综述seMeans&Feeney1990)。
对于本发明方法,已选择修饰半胱氨酸的物质作为蛋白修饰化学物质来破坏非保护性酶的活性。对N-乙基顺丁烯二酰亚***的敏感性已广泛用于细胞DNA聚合酶的分类。通常将该试剂直接加入反应混合物中,它有效“抑制”所有哺乳动物DNA聚合酶,DNA聚合酶β除外。在不同的逆转录病毒RT的共有氨基酸序列中半胱氨酸的数量具有显著差异,即HIV1RT仅有2个半胱氨酸,HIV2有3个半胱氨酸,小鼠白血病病毒(MULV)有8个半胱氨酸,而禽类成髓细胞瘤/肉瘤病毒在β亚基上有12个半胱氨酸。因此可预料病毒RT对半胱氨酸修饰的敏感性存在显著的差异。修饰HIVRT中的半胱氨酸残基的作用已有研究,并且至少HIV1和HIV2RT的DNA聚合酶活性是相当稳定的(Hizi等人1992)。考虑到已记载的不同HIV株中的巨大变异,这不见得对全部HIV分离株都成立。
更具体地讲,本发明涉及一种从包含非保护性酶的生物样品中的包膜病毒中回收酶活性的方法,该方法包括以下步骤a)将所述生物样品和半胱氨酸改性物质温育以破坏非保护性酶的活性而保留病毒包膜内的病毒酶活性,b1)从所述温育混合物中取出包膜病毒体,或b2)用一种使病毒包膜不被裂解的灭活物质灭活半胱氨酸改性物质,c)用一种裂解缓冲液裂解所述病毒包膜来释放病毒酶,d)从所述裂解缓冲液中回收所释放的病毒酶。
在本发明方法的一个实施方案中,包膜病毒选自逆转录病毒科家族,特别选自慢病毒属、HTLV/BLV病毒、哺乳动物D-型逆转录病毒和哺乳动物C-型逆转录病毒。
在优选实施方案中所述慢病毒属是人类免疫缺陷性病毒(HIV)。
在另一实施方案中回收的病毒酶活性是逆转录酶(RT)活性。
在本发明方法的又一实施方案中生物样品是一种体液样品。体液的实例有尿、唾液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、腹水液,特别是血液、血浆和血清。
在本发明方法的更进一步实施方案中所述半胱氨酸改性物质是一种水溶性非亲脂物质,如N-乙基顺丁烯二酰亚***、硫柳***、对羟基***基苯甲酸酯、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸),2-氨乙基2’-氨基乙烷硫代磺酸酯,2-硝基-5-硫***基苯甲酸和***甲烷硫代磺酸酯。
再一个实施方案中所述灭活物质是一种温和的低分子量还原剂,如半胱氨酸、半胱***、巯基琥珀酸或谷胱甘肽。
本发明还涉及一种商业包装盒,其包括从存在于生物样品中的包膜病毒中回收酶活性的实验步骤的书面说明书和/或数据载体说明书以及一种半胱氨酸改性物质,如N-乙基顺丁烯二酰亚***、醋酸苯***、硫柳***、对羟基***基苯甲酸酯、或5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。所述商业包装盒也可任选包含病毒结合基质,如阴离子交换基质,或一种灭活所述半胱氨酸改性物质而保持病毒包膜不被裂解的物质,如半胱氨酸、半胱***、巯基琥珀酸、或谷胱甘肽,以及一种裂解缓冲液,如包含去污剂的适合酶测定的缓冲液。
现在通过对各种实验、实施例和附图的全面描述来说明本发明,但应当理解的是,本发明不限于所公开的实施方案。
实验概述下列方法是用来说明本发明而不是限制它的使用。本发明的两个不同的实施方案可用做不同的目的。方案I)主要用于含有酶活性封闭性抗体的样品(如HIV病人血清阳转后的血浆),它在测定病毒酶活性前必须先除去。下面方案中的聚合酶灭活步骤可用单独温育步骤完成。也可以选择在病毒体结合于凝胶上的同一步骤中完成。这可以通过直接加半胱氨酸改性物质到血浆/凝胶浆混合物中或通过所述物质先结合到凝胶上、然后再加入血浆样品来实行。所需的改性物质浓度可以随方法而变化。方案
II)可用于基本没有干扰因子如酶封闭性抗体的样品,如HIV急性期血清。
I)用于测定含RT封闭性抗体的材料的逆转录病毒RT的方案,所述方案以破坏可溶性的细胞酶继之以从微型柱分离病毒RT为基础1)标记所需使用的5ml塑料管。将它们放于Nalgene盒子中。加1ml样品(如HIV感染个体的EDTA血浆)到每种标记的管中。加入100μl66mM的5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)缓冲水溶液,涡旋混合并于室温下温育样品1小时。
在这个过程中游离的血浆酶活性被破坏而病毒体内包含的酶仍保持完整。然后通过几个分离步骤从5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、酶活性封闭性抗体以及其它可能干扰病毒RT定量的物质中纯化病毒体。以下的方案以使用FractogelEMDTMAEHicap凝胶为基础。
2)仔细悬浮所述分离胶并向每个样品的预处理管中转移1500μl凝胶浆。
3)将所述试管放入轨道式摇床上于室温温育样品和凝胶浆1小时。
4)标记所需数目的15ml塑料微型柱,以鉴定要分析的样品。将所述柱管安装在一个柱型洗涤装置中,如SupelcoVisiprep固相提取真空歧管。转移上述结合管中的内容到它们相应的柱中。转移前短暂涡旋所述塑料管以均匀分散凝胶。
5)当所有微型柱被填充后,用真空吸干凝胶。关闭真空并开始用9ml缓冲液A填充每一微型柱进行洗涤。当所有的微型柱被填充后,用真空吸干凝胶。
6)再重复步骤5三次,总共洗涤4次。每次洗涤后吸干凝胶。在第4次洗涤后吸干凝胶后,关闭真空并继续第7步。
所述洗涤步骤从系统中除去了未结合的RT封闭性抗体和5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。
7)向所有干胶中加入9ml调节缓冲液(B)。用真空吸干凝胶。
8)重复步骤7。在关闭真空控制前所有的调节缓冲液(B)已从凝胶中去除。
9)卸下柱状洗涤装置的上部分。将具有标记塑料管的管架安装入一个干净的容器中。重新安装装置的上部分。控制所述小管从每一柱管沉入其相应的塑料管中。
10)加300μl裂解缓冲液(C)到每一柱管中。让所述缓冲液位于柱管中5分钟。然后,用真空慢慢吸干凝胶。这样每管将含有大约300μl病毒裂解产物。
从第10步的裂解产物中回收的RT活性基本上没有RT封闭性抗体和细胞聚合酶活性,而且可以用灵敏的RT活性测定方法,例如基于Ekstrand等人1996年描述的方法Cavidi-HS-kitLentiRT,定量测定所述RT活性。
注意RT酶对半胱氨酸改性物质不敏感,例如野生型HIV1RT
,任选在有高达5mM5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)存在的情况下测定。
另一方面,敏感性酶如MuLVRT和来自于某些治疗抗性HIV1病毒株的RT,需要添加巯基还原剂(如半胱氨酸或半胱***)到裂解缓冲液中。
II)用于测定样品中基本没有酶封闭性抗体的RT活性的方案,如HIV急性期血浆或病毒培养上清夜,所述方案以可溶的细胞酶灭活接着以5,5′-二硫代双(2-确基苯甲酸)灭活为基础。
1)将200μl样品(如HIV急性期血浆)与20μl33mM5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)缓冲水溶液混合。于室温下将样品在轨道式摇床上温育1小时。
2)加入巯基还原剂,如20μl33mM半胱***,于室温下将样品在轨道式摇床上再温育30分钟。
3)用含去污剂如tritonX-100的适合RT测定的缓冲液四倍系列稀释样品。现在所述病毒体裂解并且每一稀释液的RT活性可以用灵敏的RT测定如Cavidi-HS-kitLentiRT来测定。
4)如果样品稀释度和形成的产物量之间呈线性关系,则最初样品中的RT活性量根据稀释度范围内数值来计算。
实施例材料分离胶如FractogelEMDTMAE或FractogelEMDTMAEHicap在200mM(2-(N-吗林代)乙磺酸
)(MES),275mM碘化钾和肝素80IU/ml中的分离胶。
微型柱如BioradPoly-Prep(7311553)微型柱洗涤装置如SupelcoVisiprep固相提取真空歧管。
。
半胱氨酸改性剂,例如66mM5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(羟乙基)氨基甲烷的缓冲水溶液中()。
温和的巯基还原剂,如33mM半胱***水溶液。
洗涤缓冲液(A),500mM醋酸钾(KAc)。
调节缓冲液(B)一种适合RT测定的缓冲液,如10mM(N-(2-羟乙基-哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes),25mMKAc,20mM***化镁(MgCl2),(β-氨基***)N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA),2mM精***。
裂解缓冲液(C)一种适合RT测定的缓冲液,包括一种去污剂如1%t-八苯氧基聚乙氧基乙醇(tritonX-100)、一种酶稳定剂如13ng/ml寡聚(dT22)、(B)同样的组分。由于RT对SH氧化/修饰敏感,所以在处理含RT的病毒时可任选添加一种巯基还原剂,***。
附图简述
图1显示了用硫柳***预保温对血清/血浆中不同聚合酶活性的作用。重组野生型HIV1RT(■),来自一种HIV1突变体