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专利名称:乙酰乳酸合成酶突变体及其应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及植物遗传育种领域。具体地,本发明涉及乙酰乳酸合成酶突变体及其应用。更具体地,本发明涉及乙酰乳酸合成酶突变体、分离的核酸、表达盒、载体或细胞、获得具有除草剂抗性的植物的方法以及由权利要求8或9所述方法获得的植物的鉴定方法。
背景技术:
农田中杂草是影响农作物产量的最重要因素之一,而人工除草所需要消耗的人力资源和成本很高,而且不便于农业集约化生产,严重制约了农作物种植向高产、优质和低成本方向的发展进程。因此,除草剂就运应而生。然而,除草剂通常也能杀死农作物本身,因此对一般不具有除草剂抗性(耐受性)的农作物而言,除草剂的使用在时间和空间上受到了极大限制。为此,人们研究开发具有除草剂抗性(耐受性)的植物(农作物),这样可以在种植期间使用除草剂,杀死杂草,但不影响植物本身的生长,由此拓宽了除草剂的使用范围。然而,具有除草剂抗性的植物及其起决定性的物质(如蛋白、基因等)目前还没有理论来定向设计出。因此,目前寻找使植物具有除草剂抗性的蛋白质并对其加以应用的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种新的使植物具有除草剂抗性的蛋白质,以及将其应用于具有除草剂。为此,根据本发明的一个方面,本发明提出了一种乙酰乳酸合成酶突变体。根据本发明的实施例,与野生型乙酰乳酸合成酶相比,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体的Alal73和Trp542的至少之一具有突变。根据本发明的实施例,发明人分离到乙酰乳酸合成酶的新突变体,并分析确定了该突变体能够使植物具备除草剂抗性,从而通过使植物表达本发明的乙酰乳酸合成酶突变体,能够该植物具备除草剂抗性。根据本发明的另一方面,本发明还提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例,该分离的核酸编码前面所述的乙酰乳酸合成酶突变体。根据本发明的实施例,将本发明分离到的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸导入植物,使其表达前述本发明的乙酰乳酸合成酶突变体,能够使该植物具备除草剂抗性。根据本发明的又一方面,本发明还提出了一种表达盒、载体或细胞。根据本发明的实施例,该表达盒、载体或细胞包含前面所述的本发明的核酸。由此,利用本发明的表达盒和载体能够有效地将本发明的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸导入植物,使该植物表达前述本发明的乙酰乳酸合成酶突变体,从而使其具备除草剂抗性。此外,发明人发现,本发明的细胞能够表达本发明的乙酰乳酸合成酶突变体,具备除草剂抗性,经培养后能够有效地成为具备除草剂抗性的植物。根据本发明的再一方面,本发明还提供了前面所述的乙酰乳酸合成酶突变体、核酸以及表达盒、载体或细胞,在获得具有除草剂抗性的植物中的用途。根据本发明的实施例,如前所述,利用本发明的表达盒、载体及细胞能够有效
地获得具备除草剂抗性的植物。根据本发明的又一方面,本发明还提供了一种获得具有除草剂抗性的植物的方法。根据本发明的实施例,该方法通过下列途径的至少之一实现(1)使植物包含本发明的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸;(2)使植物表达本发明的乙酰乳酸合成酶突变体。根据本发明的实施例,利用该方法能够有效地获得具备除草剂抗性的植物。根据本发明的另一方面,本发明还提出了一种由前面所述的获得具有除草剂抗性的植物的方法而获得的植物的鉴定方法。根据本发明的实施例,该方法包括如下步骤的至少之一(I)测定所述植物是否包含本发明的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸;(2)测定所述植物是否表达本发明的乙酰乳酸合成酶突变体。由此,利用该方法,能够有效地鉴定通过本发明的获得具有除草剂抗性的植物的方法而获得的植物是否具备除草剂抗性。需要说明的是,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体及其应用,是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作而完成的。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的
描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中图I显示了根据本发明一个实施例的2株玉米京21号乙酰乳酸合成酶突变植株。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。首先,需要说明的是,乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,ALS),其酶分类编号为EC4,。乙酰乳酸合成酶是支链氨基酸合成中的一个关键酶,如在缬氨酸和亮氨酸的合成中催化***酸生成乙酰乳酸和二氧化碳,在异亮氨酸的合成中催化***酸与丁***酸生成2-乙醛基-2-羟基丁酸。目前,已经发现ALS突变蛋白在不同植物(包括玉米、小麦、水稻、油菜、和向日葵等)的同源蛋白的第122、155、197、205、574、653、和/或654等位点会产生突变,从而使得相应植物对咪唑啉***类、磺酰脲类、三唑嘧啶类和嘧啶水杨酸类等除草剂产生抗性(可参见TanS,EvznsRR,DahmerML,-tolerantcrops:History,
,61:246—257;TanSjEvznsRR,DahmerML,-tolerantcrops:History,currentstatusandFuture[J]·,61:246-257,通过参照将其全文并入本文)。然而,没有报道表明,在来自玉米的ALS的第173或542位突变,会使得相应植物(尤其是玉米)具有除草剂抗性。然而,本发明的发明人从突变的玉米植株中发现并分离得到了在第173或542位具有突变的新的乙酰乳酸合成酶突变体,且发现这些突变能够使植物具备除草剂抗性。乙酰乳酸合成酶突变体及其编码核酸为此,根据本发明的一个方面,本发明提出了一种乙酰乳酸合成酶突变体。根据本发明的实施例,与野生型乙酰乳酸合成酶相比,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体的Alal73和Trp542的至少之一具有突变。根据本发明的实施例,发明人分离到乙酰乳酸合成酶的新突变体,并分析确定了该突变体能够使植物具备除草剂抗性,从而通过使植物表达本发明的乙酰乳酸合成酶突变体,能够使该植物具备除草剂抗性。目前,以抑制ALS为靶位的除草剂包括磺酰脲类、咪唑啉***类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类等除草剂。发明人发现,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体能够使植物对上述除草剂均具备抗性。根据本发明的实施例,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体能够使植物具备良好的咪唑啉***类除草剂抗性,尤其是咪草烟抗性。其中咪草烟的化学名称为
(RS)5-乙基-2-(4-异丙基-4-***-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)烟酸,CAS号为81335_77_5。根据本发明的实施例,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体的Alal73和Trp542突变的突变类型不受特别限制。根据本发明的一些具体示例,与野生型乙酰乳酸合成酶相比,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体具有选自下列的至少一种突变Alal73Val和Trp542Cys,即从野生型乙酰乳酸合成酶氨基酸序列的第173位的Ala突变为Val或第542位的Trp突变为Cys。优选地,根据本发明的实施例,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体具有SEQIDNO2或4所示的氨基酸序列。此外,本领域技术人员了解,在蛋白质序列已知的情况下,本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入表达载体,就可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质(可参见《分子克隆实验指南》,北京科学出版社,2002年,通过参照将其全文并入本文)等文献中,因此,除了上述列举的SEQIDN0:2或4所示的氨基酸序列之外,本发明的乙酰乳酸合成酶突变体还可以包括对前述氨基酸序列进行氨基酸取代、添加或缺失而不影响其性质的蛋白质。根据本发明的另一方面,本发明还提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例,该分离的核酸编码前面所述的乙酰乳酸合成酶突变体。其中,在本文中,有时也将本发明的核酸称为本发明的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸。根据本发明的实施例,将本发明分离到的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸导入植物,能够使其表达前述本发明的乙酰乳酸合成酶突变体,从而能够使该植物具备除草剂抗性。在本文中,本发明的分离的核酸的类型不受特别限制,可以是任何包含与乙酰乳酸合成酶突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和
/或核糖核苷酸的聚合物,包括但不限于DNA、RNA或cDNA,优选DNA。根据本发明的实施例,与野生型乙酰乳酸合成酶基因相t匕,。其中,根据本发明的一些实施例,本发明的分离的核酸具有SEQIDNO:1或3所示的核苷酸序列。此夕卜,在知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下,通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率,运用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法,本领域技术人员有能力获得并优化编码本发明的乙酰乳酸合成酶突变体的核酸。进而,获得本发明的核酸后,可以将其克隆入载体,再转化或转染入相应的细胞,然后通过常规的宿主细胞进行增殖,从中分离得到大量的核酸。表达盒、载体或细胞
根据本发明的又一方面,本发明还提出了一种表达盒、载体或细胞。根据本发明的实施例,该表达盒、载体或细胞包含前面所述的本发明的核酸。由此,利用本发明的表达盒和载体能够有效地将本发明的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸导入植物,使该植物表达前述本发明的乙酰乳酸合成酶突变体,从而使其具备除草剂抗性。此外,发明人发现,本发明的细胞能够表达本发明的乙酰乳酸合成酶突变体,具备除草剂抗性,经培养后能够有效地成为具备除草剂抗性的植物。根据本发明的实施例,优选地,本发明的表达盒适于在植物中表达本发明的核酸。根据本发明的一些实施例,本发明的表达盒在
5’-3’的转录方向上依次包含启动子区、本发明的核酸以及转录和翻译的终止区。根据本发明的一些具体示例,在本发明的表达盒中,启动子可以选自CaMV35S启动子、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米矮缩I基因和烟草花叶病毒(TMV)Ω元件的启动子的至少之一。根据本发明的一些实施例,在本发明的表达盒中,转录和翻译的终止区可以包括转录终止元件或多聚腺苷酸化信号。根据本发明的一些具体示例,本发明的表达盒可以进一步包括在细菌中复制所需的复制起点(例如,来自pBR322或P15Aori的ORI区),以及土壤杆菌T-DNA转移所需要的元件(例如,T-DNA的左边界和/或右边界),从而方便从细菌往植物中的转化过程。根据本发明的一些实施例,本发明的表达盒还可以进一步包括增强子、内含子、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点和转录因子结合位点,例如可以采用选自TMV、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列的至少之一作为增强子,可以采用选自AdhUbronzeI、肌动蛋白I和肌动蛋白2的至少之一作为内含子。需要说明的是,在本文中所使用的术语
“载体”是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。根据所应用的目的不同,载体可以分为克隆载体、表达载体和转化载体,其目的分别为针对克隆并验证基因、表达相应基因和将相应基因转化。根据本发明的实施例,本发明的载体可以包括但不限于在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。根据本发明的实施例,本发明的载体可以为转化载体,优选为植物转化载体,更优选为适合农杆菌转化植物的载体。根据本发明的实施例,本发明的细胞的类型不受特别限制。根据本发明的一些具体示例,本发明的细胞可以是原核细胞,也可以是真核细胞,如,细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。需要说明的是,前述的“植物细胞”是指来自植物的细胞(可以包括细胞群,但优选是单个细胞),但是这些细胞不能仅仅借助光合作用而以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来发育成存活的单个植株。根据本发明的实施例,本发明的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸可以被插入任何适于转化进细胞的载体。根据本发明的实施例,优选地,本发明的细胞是细菌细胞,尤其是用于克隆或储存核酸、或转化植物细胞的细菌细胞,例如农杆菌、大肠杆菌,包括根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌等。根据本发明的另一些实施例,本发明的细胞是植物细胞,优选玉米细胞,更优选京
21玉米细胞。根据本发明的实施例,前述植物细胞中包含的本发明的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸可以是通过转基因技术导入植物细胞的,例如可以导入到植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中,也可以是通过突变技术使得本发明的核酸存在于植物细胞中的。用途根据本发明的再一方面,本发明还提供了前面所述的乙酰乳酸合成酶突变体、核酸以及表达盒、载体或细胞,在获得具有除草剂抗性的植物中的用途。根据本发明的实施例,如前所述,利用本发明的表达盒、载体及细胞能够有效地获得具备除草剂抗性的植物。根据本发明的实施例,本文中所述的除草剂为以抑制ALS为靶位的除草剂,例如磺酰脲类、咪唑啉***类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类等除草剂,优选咪唑啉***类除草剂抗性,更优选咪草烟。基于前述的用途,根据本发明的又一方面,本发明还提供了一种获得具有除草剂抗性的植物的方法。根据本发明的实施例,本发明的获得具有除草剂抗性的植物的方法可以通过下列途径的至少之一实现(1)使植物包含本发明的编码乙酰乳酸合成酶突变体的核酸;(2)使植物表达本发明的乙酰乳酸合成酶突变体。发明人惊奇地发现,利用该方法能够有效地获得具备除草剂抗性的植物。根据本发明的实施例,本发明的获得具有除草剂抗性的植物的方法所适用的植物的种类不受特别限制。根据本发明的一些具体示例,本发明的获得具有除草剂抗性的方法对是单、双子叶植物均适用,尤其适用于水稻、小麦、油菜、玉米、棉花、谷子和苜蓿,更优选玉米。根据本发明的实施例,通过本发明的获得具有除草剂抗性的植物的