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专利名称:乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法和应用的制作方法
技术领域:
本发明属酶抑制剂的筛选方法,特别涉及的是乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法。
创制超高效低毒除草剂的首要任务是寻找先导化合物。快速,准确地发现先导化合物需要全新意义的,分子水平的离体筛选方法。选用乙酰乳酸合成酶(AcetolactateSynthase,缩写ALS)做靶标,是当前国际上除草剂研究和开发的前沿热点。ALS酶抑制剂被誉为“农药科学发展史中的里程碑”。现已确认磺酰脲类,咪唑啉***类,及三唑并嘧啶类化合物为ALS酶的抑制剂。新结构类型的ALS酶抑制剂也不断涌现。目前国内有一般的整体测定除草活性的盆栽筛选方法,该法判定筛选效果所需时间长,一般要10到14天,通过观查和手工测量给出结果。其结果误差较大,灵敏度低,而且不能有效地阐明抑制作用机理。经检索,美国专利US5,141,870号公开了核酸碎片编码的除草抗性植物;US5,206,135号公开了氧敏感电极测ALS酶活性。两份专利未论及ALS酶抑制剂筛选方法。国际上有的文献公开了有关酶促反应的一些资料,但也是零星的,如①.,.,PlantPhysiology,76,545-546(1984)植物生理学杂志
②.,JournalofBacteriology,121,917-922(1975)细菌学杂志③GiusepptForlanl,WeedScience,39,553-557(1991)杂草科学杂志文献①报导了酶促反应溶液组成和浓度,K2HPO420mM,***酸钠20mM,,。组成中金属离子用的是锰离子,反应结束后还需离心,除去沉淀,硫酸根的存在也影响产物的生成。文献①,②,③,该值较小,说明加入的各反应物更少,引起相对误差会更大,易误导抑制活性的测定结果。文献②虽给出了酶促反应时pH值和光密度E的关系,但在pH4-8范围内没有稳定的E值,无最佳pH范围会导致测定光密度E值不准确。上述资料中均未完整报导乙酰乳酸合成酶抑制剂的筛选方法,所以该方法目前在国内外公开发表的资料中还是空白。国家“八五”技攻关项目中已明确提出“努力创建新的筛选模型”,这就是我们当前的任务。
本发明的目的是建立一套完整,规范,全新的分子水平离体乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法。要求该方法离开植物体,在实验室的试管中将被筛选物在乙酰乳酸合成酶的催化作用下参加反应,通过酶促反应速率下降,即产物的减少,快速,准确地计算被筛选物的抑制活性,从而筛选出乙酰乳酸合成酶的抑制剂。
本发明的又一目的是应用上述方法,快速,准确地确定抑制剂化合物的乙酰乳酸合成酶抑制中浓度
Ic50值,从而筛选出有可能开发为高效除草剂的先导化合物。
,酶促反应的反应物由乙酰乳酸合成酶的底物,辅酶,和缓冲液配制而成,反应过程为测定反应体系中不合被筛选物的酶促反应速率V0和反应体系中加入被筛选物后的,被抑制的酶促反应速率V1,根据二者比值确定抑制活性百分数i%,其公式为i%=(1-V1V0)×100%---(1)]]>反应速率V可用测定酶活即随时间而变化的产物的增加量代表,用E表示,则公式(1)成为i%=(1-E1E0)×100%---(2)]]>根据测定的E值,计算出被筛选物的抑制活性i%,根据抑制活性i%判断是否为抑制剂及抑制剂的优劣,就可筛选出抑制剂,其筛选过程包括以下步骤(1).首先选用质量与数量相同的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂;(2).确定能完全溶解被筛选物的一种溶剂,并配制其溶液;(3).确定进行酶促反应的反应物中底物,辅酶,和缓冲溶液的组成及浓度;(4).在有酶,水,和缓冲溶液配成的反应液中,再按以下四种情况(I,II,III,IV)加入不同的物质进行酶促反应,分别测出四种情况下的产物量E值;;
EB;;;(5).确定乙酰乳酸合成酶的活性E0,该活性等于加入反应物后的酶促反应产物量EB与没有反应物时的酶促反应产物量EA之差,该值表达式E0=EB-EA(6).确定乙酰乳酸合成酶在有被筛选物存在时的残余活性E1,该值表达式E1=EB1-EA1(7).根据上述的公式(2),计算被筛选物的抑制活性。
,系指乙酰乳酸合成酶在无(外加)酶反应物的酶反应条件下,仍不断进行酶促反应,产生的产物为空白。
-12μM/mg·hr,酶促反应的反应物中底物,辅酶,和缓冲溶液的组成及浓度和酶促反应的条件及产物如下缓冲液磷酸氢二钾K2HPO420mM底物*********,,在常压,39—40℃下,进行一小时酶促反应,生成产物乙酰乳酸。
—。
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,其特征在于所述的测酶活的方法可用分光光度法,系测定乙酰乳酸在硫酸作用下转化为3-羟基丁***的含量,反应过程为分光光度法依次包括如下步骤(1).—,6N的H2SO4;(2).将上述溶液在59—60℃下恒温15分钟;(3).—,%的肌酸(一种含胍基化合物);(4).再加入1—2ml,5%的1-碱萘酚,生成红色络合物;(5).测定溶液体积为3—7ml;在59—60℃,常压下恒温20分钟;(6).取出溶液,摇匀后静置30—40分钟;(7).用分光光度仪测定E值,波长为520nm,1cm比色皿。
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***体系。
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,可用于确定被筛选抑制剂的ALS酶抑制中浓度IC50值,据此确定创制新农药时的先导化合物,其确定步骤如下(1).选用不同浓度的同一种抑制剂,按权利要求1所述的方法,分别同时进行酶促反应;(2).根据酶促反应结果,得到不同浓度时对应的酶活值,进而确定同一抑制剂在不同浓度时的残余活性百分数,即100%-i%;(3).用抑制剂的浓度及所对应的残余活性百分数为坐标,绘制灵敏度曲线
;(4).根据曲线找出残余活性为50%时,也就是抑制活性i%为50%时所对应的浓度,即为该抑制剂的ALS酶抑制中浓度IC50值,据此确定创制新农药时的先导化合物。
本发明的方法是以酶活及酶活的测定为基础。酶活指酶催化一定的化学反应的能力,实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速率。在酶促反应中,若加入一种化合物能抑制或阻断酶的催化能力,化学反应的速率将发生变化,我们可以选择不同的技术手段,测定随时间而变化的底物的减少或产物的增加,来代表催化反应的速率。通过被筛选化合物存在和不存在两种条件下的酶促反应速率的比较,计算抑制活性,从而筛选出高抑制活性的抑制剂化合物。
乙酰乳酸合成酶是一种裂合酶,其催化反应类型为脱羧和碳-碳键生成。底物系列是(ⅰ)***酸,(ⅱ)***酸和α-丁***酸;产物系列是(ⅰ)乙酰乳酸,(ⅱ)乙酰羟基丁酸;经转化而适于测定的产物系列为(ⅰ)3-羟基丁***,(ⅱ)丁二***。
乙酰乳酸合成酶在辅酶硫***素焦磷酸,黄素腺嘌吟双核苷酸,及镁离子的存在下,在适宜的磷酸盐缓冲液中,催化底物***酸为产物乙酰乳酸。随时间而变化的乙酰乳酸的含量代表了该化学反应速率。乙酰乳酸可用气相色谱法测定,也可用分光光度法测定。若用分光光度法测定,则在产物乙酰乳酸中加入硫酸,停止酶促反应,乙酰乳酸同时转变为3-
羟基丁***,在一种含胍基化合物肌酸的作用下,3-羟基丁***与1-碱萘酚形成红色络和物。由络和物光吸收曲线确定络合物最大吸收波长520nm为测定波长,用1cm比色皿比色,以光密度E值计算产物含量,见
图1。图中横坐标为吸收波长,单位为nm;纵坐标为光密度值E;虚线为络合物光吸收曲线;实线为空白。
-40℃的情况下,反应产物与反应时间有关,若以60分钟为准,30分钟时约为其70%。
。图中横坐标为pH值;纵坐标为光密度值E。
,温度和pH值恒定时,反应产物与酶浓度成线性关系,见图3。图中横坐标为酶用量,单位为ml;纵坐标为光密度值E。
,温度和pH值恒定时,反应速率随底物浓度而改变,并且在某一浓度下达最大值V,V/2时的底物浓度即为米氏常数Km,本实验值为3-4mM,见图4。图中横坐标为底物浓度单位为mM;纵坐标为光密度值E。
,有关参数的确定都是通过实验获得的。包括脱羧时加硫酸的用量;肌酸用量;1-碱萘酚用量;显色反应的温度;络和物稳定时间的确定;和标准物3-羟基丁***的工作曲线,可分别依次见图5;图6;图7;图8;图
9;和图10。图5中,横坐标为6NH2SO4的用量,单位为ml;纵坐标为光密度值E。图6中,%肌酸的用量,单位为ml;纵坐标为光密度值E。图7中,横坐标为5%1-碱萘酚的用量,单位为ml;纵坐标为光密度值E。图8中,横坐标为溶液显色反应温度,单位为℃;纵坐标为光密度值E。图9中,横坐标为标准物3-羟基丁***的用量,单位为μg;纵坐标为光密度值E;a曲线为显色55分时的测定值;b曲线为显色75分时的测定值;c曲线为显色25分时的测定值。图10中,横坐标为标准物3-羟基丁***的用量,单位为μg;纵坐标为光密度值E。
本发明所用的乙酰乳酸合成酶是中国科学院化工冶金研究所生产的专利产品,其他原料均可在市场上购得。
应用本发明的方法,我们筛选了多种被筛选化合物,其中,发现了两种具有卓越抑制活性的化合物Y-14和Y-29,同样应用本发明乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法,可通过灵敏度曲线得到抑制中浓度IC50值,这将在实施例11和12中介绍。
***磺隆相近的化合物Y-14和Y-29,在用药量相同的情况下,***磺隆抑制活性为59%,Y-14为52%,Y-29为42%。***磺隆的IC50值(抑制活性为50%时的用药浓度)为72μM,Y-14的IC50值为66μM,Y-29的IC50值为151μM。
这两种结构新颖的化合物由于确定了是高效的ALS酶抑制剂,就是有前途的先导化合物,有可能在此基础上,经结构优化开发成新的高效除草剂。
,避开了现有整体实验的长过程,排除了传输,代谢等过程的干扰。因此,在4小时内,一个工作人员可筛选10—20个化合物,并计算出抑制活性。
,即可给出筛选结果结果。这将对那些合成反应产率低的化合物也可顺利进行评价,无需加大原料用量,也节约了开发费用。
,又不影响酶促反应和测定体系的四种溶剂,使难溶解的被筛选化合物也能溶解,同时,测定了同一被筛选化合物在不同溶剂体系下的抑制活性,其结果相近,说明方法可靠。
,准确性好针对酶促反应特点,本发明提出了新的空白概念,它不同于通常理解的“试剂空白”概念。新的空白概念是,酶在无酶反应物的酶反应条件下,进行的酶促反应的产物为空白。设计程序扣除了这部份空白,因此计算值能准确地反映抑制剂的抑制活性。
方法设计中,考虑了各种影响稳定性,准确性的因素,诸如底物浓度值,溶液pH值的控制,脱羧时硫酸用量等等,通过大量实验,确定了操作条件。测量方法采用分光光度法,设计了独特的操作程序。①考虑了溶剂本身引起的光密度值变化,选用相同溶剂,相同用量下进行比较,因此可抵消溶剂效应造成的误差,
②可抵消系统误差,因此,最终的测量结果好于一般的生测方法,相对误差不大于3-5%。
,可测化合物的抑制活性范围为0-100%。
本发明经过大量实验,;;
;;;%肌酸用量的关系曲线;%1-碱萘酚用量的关系曲线;;;-羟基丁***的工作曲线;;***磺隆的灵敏度曲线;;-14的灵敏度曲线;-29的灵敏度曲线。
以下结合实施例和附图,对本发明作进一步介绍。
实施例1化合物***磺隆的筛选验证实验(1)首先选用比活值为5-12μM/-;(2)能够完全溶解被筛选的***磺隆化合物的溶剂是二甲亚砜,将10mg的***磺隆样本溶解在5ml二甲亚砜溶剂中,配制成浓度为