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专利名称:与水稻粒形和株高相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及植物基因工程领域中的蛋白质及其编码基因与应用,特别涉及与水稻粒形和株高相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术:
水稻作为一种重要的粮食作物,其产量的重要性不言而喻。籽粒的重量(一般用千粒重表示)是水稻产量的三大构成因素之一;籽粒形状和大小直接影响了籽粒的重量,是水稻产量的决定因素之一。同时,籽粒的形状和大小还直接决定碾净去糠大米的外观和大小,因而又是稻米品质的决定因素之一。植株高度是水稻株型建成的重要农艺性状之一,直接影响水稻品种的抗倒性能和丰产潜力。由此可见,分离和鉴定与水稻粒形和株高相关的功能基因,对于利用基因工程技术改良水稻性状,从而提高和稳定水稻产量、提升稻米外观品质具有重要的意义。目前在水稻中已清楚鉴定的能同时影响籽粒形状和株高的基因并不多,研究得比较深入的有DWARF1、DWARF4和DWARF11等,这些基因通过各种各样的分子途径参与调控籽粒形状和株高。DWARFl基因编码GTP结合蛋白
α亚基,参与赤霉素信号转导途径,从而在植物生长和发育中起作用,影响水稻植株的株高和籽粒的大小(Ueguchi-:11638_11643)。DWARF4和DWARFl1编码细胞色素P450,通过参与油菜素内酯的合成过程,影响水稻植株的株高和籽粒的形状大小(-790;-109)。TUDl基因编码含有U_box结构域的蛋白,也是一个控制水稻株高和籽粒大小的基因,其具体功能和调控途经还不清楚()。
发明内容
本发明的一个目的是提供与水稻粒形和株高相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与水稻粒形和株高相关的蛋白,名称为0sKineSin-13A,来源于水稻(OryzasativaL.),是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻粒形和株高相关的由(a)衍生的蛋白质。序列表中的序列1由819个氨基酸残基组成。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述(a)中的
0SKineSin-13A蛋白可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述(b)中的0sKinesin-13A衍生蛋白可人工合成,也可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失和/或增加一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到编码基因,再进行生物表达得到。与水稻粒形和株高相关蛋白的编码基因具体可为如下1)_3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2;2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述蛋白的基因。3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。序列表中的序列2由2460个核苷酸组成,其编码序列为自5’末端第1-2460位碱基,编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的0sKinesin-13A蛋白。(),%SDS的溶液中,65°C下进行DNA或RNA杂交实验并洗膜。含有上述与水稻粒形和株高相关蛋白的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为在pUN1301载体的多克隆位点间插入上述与水稻粒形和株高相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法,是通过抑制所述编码基因的表达水平,得到转基因植物。所述转基因植物为下述1)、2)或3)的植物1)与目的植物相比,籽粒变为圆形且
植株矮化;2)与目的植物相比,籽粒变为圆形;3)与目的植物相比,植株矮化。所述目的植物为转基因受体植物。上述抑制所述编码基因的表达水平具体可通过RNA干扰实现。所述RNA干扰是通过将双链RNA的编码DNA导入目的植物中实现的;其中,所述双链RNA的一条链的核苷酸序列是将序列2的第1587-2195位碱基序列中的T替换为U得到的核糖核苷酸序列,另一条链与其反向互补。所述双链RNA的编码DNA的是如下双链DN***段SEQ正向-X-SEQ颇;其中,SEQ正向的核苷酸序列是序列2的第1587-2195位碱基序列;与所述向互补;X是3￡0_与SEQ_之间的间隔序列,X与所述SEQf^PSEQ均不互补。所述RNA干扰是将RNA干扰载体导入目的植物中,得到转基因植物。所述RNA干扰载体是通过如下方法构建的将序列表中序列2第1587-2195位碱基序列所示的DN***段插入pTCK303质粒的SpeI和SacI酶切位点之间得到重组质粒pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列;将序列表中序列2所示的第1587-2195位碱基序列反向插入pTCK303-0sKinesin_13A-正向序列质粒的Kpnl和BamHI酶切位点之间,构成所述干扰重组表达载体。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物;所述单子叶植物为水稻。本发明中与水稻粒形和株高相关的蛋白主要控制水稻粒形和株高,通过RNA干扰降低所述蛋白编码基因的表达水平,可得到籽粒变为圆形、植株矮化的水稻。因此利用该基因可以培育籽粒为圆形、植株矮化的新型水稻品种,对提高和稳定水稻产量、提升稻米外观
品质具有重要的意义。
图1为水稻突变体sar、野生型、0sKinesin_13A基因的过量表达转基因sar突变体植株以及RNA干扰抑制表达转基因植株在成熟期植株高度的比较。其中A为野生型,B为sar突变体,C为0SKineSin-13A基因过量表达的转基因sar突变体植株;D为转化空载体对照的转基因sar突变体植株;E为0sKinesin-13A基因RNA干扰抑制表达的转基因野生型植株;F为RNA干扰对照植株,比例尺为10cm。图2为水稻突变体sar、野生型、0sKinesin_13A基因的过量表达转基因sar突变体植株以及RNA干扰抑制表达转基因植株的成熟籽粒的比较。其中A为野生型的成熟籽粒;B为sar突变体的成熟籽粒;C为0SKineSin-13A基因过量表达的转基因sar突变体植株的成熟籽粒;D为转化空载体对照的转基因sar突变体植株的成熟籽粒;E为RNA干扰对照植株的成熟籽粒;F为0sKinesin-13A基因RNA干扰抑制表达的转基因野生型植株的成熟籽粒。图3为过量表达载体pUN1301-0sKinesin_13A的图谱。图4为RNA干扰载体p0sKinesin_13A-RNAi的图谱。其中RNAi-sense表示0sKinesin_13A-正向序列片段,RNAi-antisense表示0sKinesin-13A-反向序列片段。图5为0sKineSin-13A基因在水稻中的表达模式分析。其中A为RT-PCR结果;B为实时荧光定量
PCR结果。R(Root)为7天龄水稻幼苗的根;B(Bud),4mm长的幼芽;L(Leaf)为成熟叶;St(Stem)为拔节后的茎;F(Flower)为成熟颖花;Sd(Seed)为授粉6天后的籽粒;C(Calli)为愈伤组织。图6为0sKinesin_13A抗体制备和特异性检测。其中A为0sKineSin-13A多克隆抗体与野生型水稻及sar突变体的幼苗及幼根总蛋白进行蛋白免疫印迹杂交的结果;seedling,幼苗;root,根。B为微管蛋白Tubulin单克隆抗体与野生型水稻及sar突变体的幼苗及幼根总蛋白进行蛋白免疫印迹杂交的结果。图7为0sKinesin-13A基因RNA干扰抑制表达转基因株系中内源0sKinesin_13A基因表达量的半定量RT-PCR检测。其中,WT为野生型水稻,Ll至L7为7个独立的、0sKinesin_13A基因RNA干扰抑制表达的转基因野生型水稻植株株系。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例1、与水稻粒形和株高相关的0sKineSin-13A基因的获得本发明首先通过6tlCoγ射线照射野生型水稻品种中花11(李梅芳、-29)的种子,种植经过照射的种子,从其生长得到的植株中筛选获得到一个植株矮化(图1)且籽粒长度变短、形状变圆(图2中A和B)的水稻突变体sar。然后利用微卫星标记和图位克隆技术,将
sar突变体的突变位点定位到水稻第5号染色体短臂的一段210kb的区段上,即两个微卫星标记RM405和RM7444之间。进而通过序列标记位点将突变位点精细定位到两个微卫星标记间的18kb区域内。卞艮m禾(TheRiceGenomeAnnotationProjectDatabase,http://rice,),这一区域内只有一个编码基因;该基因序列对应于序列表中序列2所示的核苷酸序列,编码具有819个氨基酸残基的蛋白质,对应于序列表中序列1所示的氨基酸序列。6tlCoY射线诱变导致的突变位点在该基因序列的第1306位,该位点的碱基A发生了缺失,从而造成蛋白序列翻译从436位氨基酸残基之后开始移码,并在464位氨基酸残基处提前终止。将该基因命名为0sKinesin-13A。
同时本发明制备了针对0sKineSin-13A蛋白的特异性多克隆抗体,通过Westernblot对抗体的特异性进行验证。具体实施办法描述如下利用DNAstar软件对0SKineSin-13A蛋白序列进行综合分析,最终选取该蛋白序列第662676位共15个氨基酸残基的多肽作为抗原肽段。该段多肽具有良好的柔韧性、高抗原指数、高表面可及性、高亲水性且无明显二级结构,适合作为抗原。将该肽段序列在NCBI及TIGR水稻蛋白数据库中进行比对搜索,没有搜索到与该序列同源性高的其他蛋白,说明该肽段是0sKinesin-13A蛋白特异性的。化学合成该肽段后偶联
KLH载体,免疫新西兰大白兔,获得0sKinesin-13A特异性的多克隆抗血清(抗体)。为验证制备的0sKineSin-13A多克隆抗体的特异性,用所述抗体对野生型水稻中花11及sar突变体15天龄幼苗和幼根的总蛋白进行了Western杂交验证。Western检测结果显示(图6中A),制备的0sKinesin-13A多克隆抗体与野生型幼苗及幼根的总蛋白进行杂交时,可得到约90kDa的单一目标蛋白条带,而与sar突变体的幼苗及幼根总蛋白进行杂交时,不能得到任何条带。由于选取0sKinesin-13A蛋白序列上第662676位多肽片段制备多克隆抗体,该抗体只特异性识别这15个氨基酸;野生型水稻的0sKinesin-13A蛋白完整表达,包含了这一肽段,因而可被制备的抗体结合而显示出约90kDa的杂交条带;而sar突变体表达的变异0sKinesin-13A蛋白是不完整,其翻译从436位氨基酸残基之后开始移码并在464位氨基酸残基处提前终止,因而不包含上述的15个氨基酸残基的多肽,无法与制备抗体结合,Western检测将无法显示出杂交条带。用Tubulin单克隆抗体同步进行的杂交显示(图6中B),上述四个总蛋白样品的Tubulin内标蛋白杂交带的亮度相似,说明四个样品的总蛋白都没有降解且上样量相近。以上结果说明本发明制备的0sKinesin-13A多克隆抗体能特异的与0sKinesin-13A蛋白结合,同时确定该抗体的效价为120,000。实施例2、0sKinesin-13A基因的功能互补验证本发明首先根据获得的
0sKineSin-13A基因的序列信息(序列2),设计了该核苷酸序列的引物对,引物1:5,-ATAAGGATCCATGGGGGACTCCGGGGAC-3,禾口引物25,-ACCGGAGCTCTTATCTGGAAGATTTCTT-3,,进行RT-PCR扩增合成0sKineSin-13A基因全序列。具体步骤为从野生型水稻中花11的成熟花序中提取总RNA作为模板,在反转录酶的催化下合成第一链CDNA;再以合成的第一链cDNA为模板,上述引物1、引物2为引物对,在高保真的T4DNA聚合酶催化下完成聚合酶链式反应(PCR),-13A基因的全长双链cDNA产物,在该基因序列两端各添加BamHI和SacI酶切位点。合成的0sKineSin-13A基因全长产物经BamHI和SacI双酶切后,连接到双元载体pUN1301(ZhenWang等,2004,PlantMolecularBiologyR印orter,22:409_417;陈惠、赵原和种康,2008,植物学通报,25:322-331)的BamHI和SacI位点之间,得到的连接产物为0sKinesin-13A基因的过量表达载体pUN1301-0sKinesin_13A(图3)。连接产物经CaCl2法转化到大肠杆菌DH5ci菌株中,涂布到含有卡那霉素(50yg/mL)的LB固体培养基上。由于双元载体PUN1301上具有卡那霉素抗性基因(图3的KanamycinR),因此质粒成功转化进入的大肠杆菌菌株将表达卡那霉素抗性基因而获得抗性,从而能在含有卡那霉素的LB固体培养基上生长。生长出来的大肠杆菌单菌落
(克隆)用上述的引物1、引物2进行PCR验证,***段的克隆;PCR验证的克隆再接种培养,用SDS碱裂解法提取菌株中的质粒,提取的质粒用BamHI和SacI双酶切,。经PCR和酶切验证的大肠杆菌阳性克隆最终还进行了测序验证,证实菌株中的质粒确实是pUN1301-0sKinesin-13A过量表达载体,且该载体上0sKinesin_13A基因全长序列与序列2所示的核苷酸序列完全一致。构建好且测序验证正确的过量表达载体pUN1301-0SKineSin-13A(图3)通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中,涂布到含有利福平(25μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上筛选阳性转化克隆,生长出来的农杆菌单克隆用上述大肠杆菌PCR鉴定法进行检测和验证,***段的克隆确定为最终阳性转化克隆。带有pUN1301-0sKinesin-13A过量表达载体的阳性农杆菌EHA105通过遗传转化法转化sar突变体水稻,获得独立的、0sKinesin-13A基因过量表达的转基因sar突变体植株(TO代);同时用带有pUN1301空载体的农杆菌EHA105菌株转化sar突变体水稻,获得转化空载体对照的转基因sar突变体植株(T0代)。分别从转基因sar突变体TO代植株及转空载体对照TO代植株上收获的种子,然后将种子置于添加了潮霉素(25mg/L)的MS培养基上进行筛选培养,获得具有潮霉