文档介绍：小鼠脾脏细胞原代培养
陈素君
200900140007
实验目的:了解原代培养的基本方法及操作过程。学****细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞,掌握细胞计数。
实验原理:细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体内进行培养,使其不断生长、繁殖,人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点,一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响,二是细胞培养便于人们对细胞内部结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术,但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官,经体外培养后,直到第一次传代为止。这种培养,首先用无菌操作的方法,从动物体内取出所需的组织(或器官),经消化,分散成单个游离的细胞,在人工培养的条件下,使其不断地生长及繁殖。
要细胞能在体外长期生长,必须满足基本要求:一是供给细胞存活所必须的条件,如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
台盘蓝氧化与还原型颜色不同,活细胞由于新陈代谢产生较强还原力,染色后呈无色,死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行,即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上(计菌器),于显微镜下直接观察计数。
细胞浓度(个/ml)=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000× 稀释倍数。
实验用品:
一、器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好
倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板
二、试剂
PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝
三、小白鼠
实验方法:
1. 细胞的原代培养
,将血放掉洗净,在酒精中浸泡3min消毒。
,将小鼠背朝下放在解剖板上,用镊子提起腹部皮肤,剪开。沿开口向两侧斜着剪开,翻起皮肤露出腹腔,即可看到白色的胃。提起胃,找到后面条状的脾,用弯头镊子取出脾,将周围的脂肪组织去除。
PBS缓冲液清洗1-2次待用。
,,用针头在脾脏上戳几个小孔,顺脾脏轻轻刮,从小孔挤出分散的细胞。
,使大块组织充分沉淀,吸取分散的细胞悬液2mL,1000r/min离心5min。
,用“枪(1mL)”加入细胞培养液2mL,在盖上加标记后待用。用“枪(200μL)”吸取塑料皿中的培养液400μL,加入离心后并弃去上清液的Eppendorf管中,用枪头吹散并混匀细胞,然后吸取200μL接种于上述塑料培养皿中,混匀,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。
2. 原代细胞观察、死活鉴定及计数
,观察培养液的颜色。然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。
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