文档介绍：小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
实验背景:
细胞培养的基本条件:
:净化工作室,风淋室,传递窗,高效过滤器,洁净层流罩,生物安全柜,超净工作台,紫外灯,电热干燥箱,滤器,高压灭菌器,抗生素
:纯水蒸馏器,纯水仪,培养板,培养瓶,CO2培养箱,培养基,血清
:倒置显微镜,酶标仪,微孔板震荡器,高速离心机,移液器
:液氮罐
净化工作室:
------ 我国药品生产洁净室(区)空气洁净度标准 -------
洁净度级别
尘粒最大允许数/立方米
尘粒最大允许数
≥
≥5um
浮游菌/立方
沉降菌/皿
100
3,500
0
5
1
10,000
350,000
2,000
100
3
100,000
3,500,000
20,000
500
10
300,000
10,500,000
60,000
NA
15
,使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面,使工作台内构成无菌环境。
:过滤除菌:大多数培养用液,如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

:
CO2培养箱设定的条件为37 ℃,5%CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题:
①用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒(90 ℃,14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度,避免培养液蒸发。
细胞培养用液的配制:
:新鲜配置的三蒸水或去离子水
:无Ca2+、Mg2+的缓冲液
PBS:NaCl g
KCl g
g
KH2PO4
加水至1000 ml
:
①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。
②胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。
③胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca2+、Mg2+% 。用滤器过滤除菌。
④胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。
⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
:
培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。
①天然培养基:
天然培养基有血清、血浆和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。
优点:营养成分丰富,培养效果好
缺点:来源受限,成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。
②合成培养基:
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基,如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点:标准化生产,组分和含量相对固定。成本低。
缺点: 缺少某些成分,不能完全满足体外细胞生长需要。
③人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如血清)。
血清中含有:
A多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等) ;
B多种金属离子;
C激素;
D促贴附物质,如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等;
E各种生长因子;
F转移蛋白;
G不明成分。
④一般说来,含5%小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死,但支持细胞生长一般需加 10%血清.
对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明,但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚.
血清中不仅存在促细胞生长因子,同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子,因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。
在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域,迫切需要用无血清培养基培养细胞.
无血清培养基的主要研制策略:在基础培养基中补充各种必需因子,如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。
无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。
1975年,Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株,近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。
无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性,减少了细胞污染,简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。
向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液,很可能不适合另一种