文档介绍：山东农业大学
硕士学位论文
荒漠地区优势地衣石果衣Endocarponpusillum Hedwing全长
cDNA文库的构建与初步分析
姓名:王延延
申请学位级别:硕士
专业:微生物学
指导教师:魏江春
2011-06-14
山东农业大学硕士学位论文
中文摘要
地衣作为一种特殊的菌藻共生复合生物或共生联合体,也被视为有控制地寄生于藻
类或蓝细菌上的真菌,即地衣型真菌,它能适应低温、干旱等恶劣的生存环境。从严寒
的南北两极到酷热的赤道,从高山到平原,从潮湿的土壤到干旱的沙漠,在其它植物不
能生长的地方,常常可以找到地衣。本研究面向干旱沙漠治理的国家需求,围绕干旱沙
漠生物地毯工程的基础研究,从地衣中筛选抗旱基因以创造抗旱转基因植物提供基因资
源和技术储备,以沙坡头地区地衣优势种石果衣(Endocarpon pusillum Hedwing)中分
离的共生菌为材料,从中进行抗旱基因筛选及其功能分析,主要进行了以下的研究:
(1)率先构建了国内外第一个地衣型真菌的全长 cDNA 文库,其文库的滴度为
×106cfu/mL,重组率为 %。根据文库小规模测序结果,筛选出 111 个全长基因序
列。这些序列在地衣型真菌中为国内外首次报道,BLAST 结果显示 42 个 CDS 序列与
非地衣型真菌有关基因的同源性大于 75%;30 个 CDS 序列与非地衣型真菌基因的同源
性为 60% -74%;28 个 CDS 序列与非地衣型真菌基因的同源性小于 60%,而 11 个 CDS
序列未发现与非地衣型真菌有同源性。由此可以推测,这些基因可能为地衣型真菌所特
有,与地衣型真菌与藻类共生相关,或者在干旱荒漠地衣生命活动中起重要作用。
(2)利用绝对定量 PCR 方法计算石果衣共生菌基因组的大小。从文库中挑选 15
个基因进行测定,选择其中 10 个扩增效率接近理论值的基因结果作为计算数据,最后
得出共生菌的基因组大小的平均值为 。
(3)利用相对定量 PCR 方法计算 rRNA 基因重复单位的数目。选择 3 个基因(SCD,
ATA, RPB11a)作为相对定量的参照基因。通过 BLAST 比对得知这三个基因在非地衣型
真菌中为单拷贝基因。最后,计算出重复单位数目的平均值为 43。
(4)构建含有原肌球蛋白(Tropomyosin-1)编码全长 cDNA 的重组载体,然后转
化入 E. coli BL21 中,经 IPTG 诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化。这将有利
于以后对地衣型真菌蛋白的研究。
全长文库的构建有利于地衣型真菌抗性基因和新基因筛选工作的开展。基因组大小
和 rRNA 基因的重复单位的测定,为全基因组测序工作奠定了基础。本研究填补了地衣
分子生物学知识的空白。
关键词:地衣;地衣型真菌;全长 cDNA 文库;基因组大小
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荒漠地区优势地衣石果衣 Endocarpon pusillum Hedwing 全长 cDNA 文库的构建与初步分析
Construction and preliminary analysis of a full-length cDNA
library from mycobiont of Endocarpon pusillum Hedwing
(lichen-forming ycota)
Abstract
Lichens, as terrestrial fungal-anisms, are widely distributed with wide
ecological amplitude ranging from cold to hot deserts and other extreme habitats. Lichens are
principal biological agents and pioneers in the rock-weathering and pedogenic processes. In
order to carry out a desert biocarpet engineering to cover the sandy desert with
drought-resistant transgenic plants, a study to screen drought-resistant genes from the arid
desert lichen is being made. The fungal partner or mycobiont of lichens was isolate