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淀粉含量测定方法大致可分为酸水解或酶程序,酸水解方法只能适用于纯淀粉样品,从而应用受到限制。酶的程序不同的前处理工序,淀粉糊化,液化及糊精,糊精水解为葡萄糖和血糖测量。AACC方法76-11指定在含水条件下的淀粉糊化高压釜中。
其次是淀粉转化为葡萄糖淀粉葡萄糖苷酶和葡萄糖的测量。AACC方法76-11低估了淀粉含量在肯定范围内的样品和材料,包括高直链淀粉玉米淀粉和很多谷物加工的产品。当今使用的大多数方法A-淀粉酶结合处理热稳定期间或紧随淀粉糊化工序。难以糊化〔如高直链淀粉玉米淀粉〕的样品,如氢氧化钠或氘代二甲亚砜〔DMSO〕溶剂。在一个过程中,以确保完全溶解,淀粉,膳食纤维的测定,Englyst和Cunmmings的包括处理淀粉脱支酶,支链淀粉酶。
为了满足格外样品的需要,尚未定量和牢靠的,程序为总淀粉Megazyme的测量产生,并备有一个总淀粉耐高温A-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶〔麦克利等〕的根底上使用的检测试剂盒。该方法已通过AOAC〔〕和AACC()。
最近,耐高温α-淀粉酶是乐观和稳定在较低的pH值变得可行。因此,我们用酶更了我们的总淀粉的方法。这种改进的主要优点是让耐高温A-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶活化在同一PH值〔〕,这反过来,简化了要执行的步骤法和生产的异构麦芽糖〔4-A-吡喃葡糖基-D-果糖〕的可能性减至最小,这是抗淀粉葡萄糖苷酶和A-淀粉酶水解。
Megazyme总淀粉分析程序可以测量总淀粉广泛的食品,饲料,植物和谷物产品〔自然或加工〕。大多数样品〔如面粉〕,淀粉完全溶解大约培育样本在100℃并有耐高温A-淀粉酶的存在。样品中含有高含量的抗性淀粉〔例如高直链淀粉玉米淀粉〕,要求预先溶解在严寒的2MKOH或相关DMSO。含有可溶性淀粉或麦芽糖糊精,烹饪用的热稳定的样品A-淀粉酶是不需要的。
原理:
耐高温α-淀粉酶水解淀粉转化为可溶的支链和直链麦芽糊精〔1〕。1〕淀粉+H2O A-淀粉酶,,100℃ 麦芽糊精
在必要的状况下,在样品中的抗性淀粉是预先溶解,由搅拌在约与2MKOH样品的。4℃进展中和,然后用A-淀粉酶〔2〕与乙酸钠缓冲液和水解。可替代地,在100℃下溶解在DMSO中是有效的。
抗性淀粉+H2OKOH中和+A-淀粉酶麦芽糊精
定量水解淀粉葡萄糖苷酶〔AMG〕到〔3〕D-葡萄糖的麦芽糖糊精。
麦芽糖糊精 AMG D-葡萄糖
D-葡萄糖被氧化成D-葡萄糖酸与1摩尔的过氧化氢〔HO〕的定量测定承受过氧化物酶
2 2
和一种醌亚***染料生产中的比色反响的释放。
〔4〕D-葡萄糖+O+H O 葡萄糖氧化酶 D-葡萄糖酸+过氧化氢
2 2
〔5〕2HO+P-羟基苯甲酸4-氨基安替比林 过氧化物酶 醌亚***染料+4HO
2 2 2
含有高浓度的D-葡萄糖和麦芽糖糊精的样品在分析前用含水乙醇〔80%体积/体积〕洗涤。单个样品的分析,可以在70分钟之内进展。20样品2h内进展分析。
特异性,灵敏度,线性度和精度:
该法是具体的α-葡聚糖〔包括淀粉,糖原,植物糖原和非抗性麦芽糊精〕。
。-葡萄糖〔〕。-葡萄糖〔〕/升,。
每次测定D-葡萄糖检测线性范围为5-100微克。在使用一个样本的解决方案,。,这对应于D-〜。样品制备过程中,假设样品稀释,结果乘以稀释倍数,即为F。假设在样品制备中,将样品称重,例如乘以10g/L,〜。
干扰:假设D-葡萄糖的转换已经完成,在测定中〔约5分钟〕指定的时间内,它可以被普遍认为没有干扰发生。然而,这可以进一步检查,通过参加D-葡萄糖〔〕的比色皿上完成。显著增加的吸光度应得到遵守。被分析样品中的干扰物质,可以识别包括内部标准。量化这一标准将有望恢复。即执行恢复试验的在最初的提取步骤中添加D-葡萄糖的样品,在样品处理和提取的损失确定。
安全性:D-葡萄糖测定中使用的试剂是不是在这个意义上的有害物质规例的有害物质。然而,浓缩缓冲液中含有作为防腐剂的叠氮化钠〔%w/v的〕。一般安全措施适用于全部的化学物质,应当坚持。
试剂盒:从Megazyme适合执行共100份测定试剂盒。试剂盒包含完整的分析方法:瓶1:耐高温α-淀粉酶〔10mL,3000U/℃或1600U/mL
℃〕。>4年,在4℃稳定。
瓶2:淀粉葡萄糖苷酶〔10mL,3300U/mL可溶性淀粉〔或200U/ml的P-硝基苯β-
麦芽糖〕℃。〕〉4年,于4℃稳定。完整的检测程序是可用在“megazyme”。
瓶3:GOPOD试剂缓冲液。缓冲液〔48mL,〕,P-羟基苯甲酸和叠氮化钠〔%重量/体积〕。〉4年,于4℃稳定。
瓶4:GOPOD的试剂酶。葡萄糖氧化酶加上过氧化物酶和4-氨基安替比林。冷冻枯燥的粉末。〉4年,于-20℃稳定。
瓶5:D-葡萄糖标准溶液〔5毫升,〕%〔重量/体积〕苯甲酸。〉4年室温瓶6:标准的常规玉米淀粉。小瓶标签上所示的淀粉含量。〉4年室温
试剂溶液/悬浮液的制备:
附注:〔实例2〕中,该酶的MOPS
〔100mM醋酸钠缓冲液,;不供给〕至30ml。存储之间冻结使用稀释的酶。分成适当大小的聚丙烯管的分装和储存在-20℃使用,并在使用过程中,尽可能保持冷冻。〉5年,于-20℃。
缓冲液稀释〔50mM,〕
。这个方案是具有黏质的,因此应取消容器安排的体积如:
毫升Combitip〔〕的EppendorfMultipette。〉3年,于4℃
方案3. 瓶3的内容〔GOPOD试剂缓冲液〕用蒸馏水稀释至1L。
注:-20℃时,会形成盐晶体,必需完全溶解,此缓冲液
用蒸馏水稀释至1L。
%〔W/V〕的叠氮化钠。这是一种有毒的化学物质,并应进展相
应防护.
,定量转移瓶含有方案3的其余局部。包
括这瓶用铝箔保护光封闭试剂。这是葡萄糖测定试剂〔试剂GOPOD〕。
假设此试剂是要被存储在冷冻状态下,优选应分成等分试样,应当是冷冻/解冻一次在
使用过程中。
颖配制试剂时,它可能是淡黄色或粉红色。这将形成一个更强的粉红色的颜色超过
2-3个月,在4℃。,读取时,用蒸馏水作比照。
方案5\6. 5和6瓶使用的内容供给。>5年,在室温下稳定。
试剂〔未供给〕:
醋酸钠缓冲液〔100mM的,〕加***化钙〔5mM〕。
〔〕到900毫升蒸馏水中。,通过参加
〔4g/100mL〕的1M氢氧化钠〔约30毫升〕。大约2个月在4℃稳定。
加2个水的***,调整容量至1升,并在4℃存储。此缓冲液中的稳定性增加,参加叠氮化钠〔〕。>2年,在室温下稳定。
附注:将pH调整后加叠氮化钠。叠氮化钠酸化释放一种有毒气体。
醋酸钠缓冲液〔,〕
〔〕加至800毫升的蒸馏水中,并用4M的氢氧化钠调整pH
。容量调整到1升蒸馏水。〔2M〕。
,搅拌溶解,调整容量至1升,在密闭容器中储存。
〔〕附加***化钙〔5mM的〕和叠氮化钠〔%w
/v的〕。可选:假设只需要依据例子2样本进展分析。
〔钠盐,六西格玛猫编号M-9381〕溶解在900毫升的蒸馏水中,并加
入1M〔10%V/V〕盐酸〔〕。***化钙和
,调整容量至1L。
〔20mM的,〕中加叠氮化钠〔%w/v的〕。可选:假设只
需要依据例子2样本进展分析。
〔〕添加到900毫升蒸馏水中用1M氢氧化钠〔4g/100mL〕
水溶液〔约60毫升〕,,溶解。调整容量至1L。附注:直到ph值调整,不应当添加叠氮化钠。叠氮化钠酸化释放一种有毒气体。
设备(推举):
(圆底;16*120毫米或18*150毫米〕。
微量移液器,100UL〔如吉尔森的Pipetman或RAININEDP-2机动饮水机〕。
例如正位移移液器的EppendorfMultipette用50毫升Combitip的〔免除细菌α-淀粉酶溶液3毫升等分〕。-〔〕
台式离心机〔转速3000转;约1800克〕。
分析天平
分光光度计在510nm处。
旋涡混合器〔如LKAYellowline试管振荡器TTS2〕。
恒温在50℃水浴锅
沸水浴管架
停顿时钟停顿掌握和预防措施:
1GOPOD试剂反响的时间不是关键的,但应当是至少20分钟。应测量在60分钟内形成的颜色。
每组测定应包括试剂空白和标准葡萄糖〔100UG一式四份〕。
+。
〔100Ug/〕+。系数“F”〔第13页和14页〕除以D-葡萄糖量〔100Ug〕的吸取度,在标准法〔如100/=〕。吸光度值会有所不同。
每组测定,应包括一个标准的面粉或淀粉样品。
每一组的GOPOD试剂,100微克葡萄糖标准最高的颜色形成的时间应当进展检查。这通常需约15分钟。
样品空白:
样品制备的例子:
使用标准检测程序[例如〔1〕〕进展的修改,在步骤4中,用3毫升蒸馏水,并且在步骤5中,用水代替淀粉葡萄糖苷酶时,可确定样品空白。或者,需要进展样品空白分析,可避开预萃取的样品用含水乙醇〔80%体积/体积〕[见实施例〔五〕]。
〔一〕不含有抗性淀粉,D-葡萄糖和/或麦芽糖糊精的谷物及食品中淀粉的测定。〔推
荐程序;〕反响。
,。
2研磨的样品〔100毫克,准确称量〕加到玻璃试管〔16*120毫米〕。确保全部的样品下
降到管的底部。
〔80%体积/体积〕,以潮湿样品和形成分散体。在旋涡混合器管
搅拌。
4马上参加3毫升耐高温α-淀粉酶〔在瓶1按1:30加试剂1;100MM醋酸钠缓冲液,〕。
反响管在沸水浴中6分钟。〔2,4和6分钟后,大力搅拌管〕。
留意:在此步骤中,将管猛烈搅拌,以确保完全均匀的淤浆〔除去结块,〕它是必不行少的。
另外,搅拌2分钟后,可以防止当酒精蒸发时一些样品流到管的顶部的可能性。
假设使用聚丙烯管,增加温育时间为12分钟,在搅拌下4,8和12分钟后。
试管放置在50℃温浴,〔淀粉葡萄糖苷酶,淀粉330U〕。用旋涡混合器搅拌,并在50℃反响30分钟。
试管的全部内容移到100mL的容量瓶中〔用漏斗以帮助转移〕。使用洗瓶彻底冲洗试管内部。用蒸馏水,调整容量,摇匀。在此解决方案中的等分试样离心10分钟,以3000rpm的转速。使用清楚,检测未稀释的滤液。
可替代地,在步骤6中,调整容量用蒸馏水到10毫升,10分钟,然后以3000rpm的转速离心。样品中含有1-10%的淀粉含量,这种解决方案是直接使用在步骤7中。等分〔〕样品中含有10-100%的淀粉,用蒸馏水稀释至10ml,然后再进展到第7步。
转移重复的等分试样〔〕中的稀释溶液到玻璃试管的底部〔16*100毫米〕。
〔包括D-葡萄糖掌握和试剂空白〕,在50℃反响20分钟。
9D--葡萄糖标准溶液〔1mg/mL〕。。
10对每个样品的吸光度,和D-葡萄糖的试剂空白在510nm处读取。
〔二〕不含有抗性淀粉,D-葡萄糖和/或麦芽糖糊精的谷物及食品中淀粉的测定。〔AOAC官
〕。
1磨谷物,。
2研磨的样品〔100毫克,准确称量〕加到玻璃试管〔16*120毫米〕。确保全部的样品下
降到管的底部。
〔80%体积/体积〕,以潮湿样品和形成分散体。用旋涡混合器搅拌。
〔2,4和6分钟后,大力搅拌管〕。
留意:在此步骤中,将试管猛烈搅拌,以确保完全均匀的淤浆〔除去结块〕,它是必不行少
马上参加3ml耐高温α-淀粉酶〔试剂4在瓶11:30;50MMMOPS缓冲液,〕。试管在沸水浴中6分钟。
的。另2min后搅拌,可以防止当酒精蒸发时一些样品流到管的顶部的可能性。
假设使用聚丙烯管,增加温育时间为12分钟,在搅拌下4,8和12分钟后。
5试管放在50℃的水浴中,参加醋酸钠缓冲液〔4毫升,200mM的,〕,然后用
淀粉葡萄糖苷酶〔,20U〕。搅拌筒放在旋涡混合器,在50℃孵育30分钟。
6。依据步骤6例〔一〕。
〔三〕总淀粉含量测定样品中含有抗性淀粉,但没有D-葡萄糖和/或麦芽糊精〔KOH格式-
推举〕。
1。磨谷物,。
2。加到研磨的样品〔〜100毫克,准确称量〕的玻璃管〔16*120〕。
3。〔80%体积/体积〕,以帮助分散,搅拌管的旋涡混合器。
4。磁力搅拌棒〔5*15毫米〕和2毫升2MKOH加到每个试管中,并搅拌约重悬浮颗粒
〔溶解RS〕。在磁搅拌器搅拌〔图1〕在冰/水浴中20分钟。
留意事项:
1。不要混用的旋涡混合器,由于这可能会导致淀粉乳化。
2。确保管内容猛烈搅拌的KOH溶液中参加。这将避开淀粉原料的块,然后将难以溶解的
形成。
5。〔〕,用磁力搅拌器上搅拌。马上参加耐高温A-淀粉酶〔1瓶〕,AMG〔2瓶〕,,放置在50℃的水浴中管。6。孵育30分钟的间歇式的旋涡混合器混合管。
7。样品中含有>10%,总淀粉含量;
定量转移至100mL容量瓶中〔使用水洗涤瓶〕的管中。使用外部磁铁,保存管中,同时搅拌棒搅拌洗涤溶液从管中,用与水的洗气瓶。调整至100mL蒸馏水拌匀。离心该溶液的等分局部在1800克10分钟。
样品中含有的总淀粉含量<10%;直接离心管在1800克为10分钟〔无稀释〕。这样的样品,在管的终体积是约。〔但是,这个量会有所不同,特别是当湿样品进展了分析,并适当音量津贴应计算〕。
proceed实施例〔一〕从第7步。
〔四〕测定样品中含有抗性淀粉的总淀粉含量,但没有D-葡萄糖和/或麦芽糖糊精〔〕。
1。磨谷物,。
2。加的研磨sampel〔〜100毫克,准确称量〕的玻璃管〔16*120〕。
3。〔80%体积/体积〕,以帮助分散,搅拌的旋涡混合器管。
4。氘代二甲亚砜〔DMSO〕中,并马上参加2mL的旋涡混合器搅拌管。管放置在大力沸水
浴5分钟后取出。
5。从步骤4的例子〔一〕或〔b〕连续进展。
〔五〕淀粉测定样品中还含有D-葡萄糖和/或麦芽糖糊精。
1。磨谷物,。
2。添加的精sampel〔〜100毫克,准确称量〕的玻璃离心管〔16*120MM,17ML的容
量〕。
3。〔80%体积/体积〕,5分钟,在80 85℃,孵育管。一个涡流搅
拌器上混合内容物,并添加其他5mL的80%V/V含水乙醇。
4。10分钟在1800克〔约3000RPM〕的长椅上离心机离心管。弃上清。
5。将沉淀重悬于10毫升80%V/V含水乙醇中,并搅拌的旋涡混合器。离心,留神地倒出
上清液。
6。从步骤4的例子〔一〕或〔b〕连续进展。
或者:
要从例如〔三〕第4步,假设样品中含有抗性淀粉。
〔六〕测定样品中的淀粉,其中淀粉中存在的可溶形式和D-葡萄糖和麦芽糖糊精是不存在的。
1。过滤样品溶液的等分试样,用Whatman1号滤纸〔或用WhatmanGF/A玻璃纤维滤纸如有必要〕。检测使用澄清的滤液。
2。该滤液中参加10毫升的玻璃管。加2毫升试剂1〔100MM醋酸缓冲液,〕,AMG
〔2瓶〕〔即AMG淀粉33U〕,在水浴孵育在50℃30分钟。音量调整至20毫升〔20克〕用蒸馏水。
3。传输重复的等分试样〔〕的底部的玻璃试管〔16*100毫米〕的稀释液。
4。,每管〔包括D-葡萄糖监控及试剂空白〕,20分钟,在50℃孵化管。
5。D-葡萄糖掌握由D-葡萄糖标准溶液〔1毫克/毫升〕。。
6。对每个样品的吸光度,和D-葡萄糖掌握在510nm处对试剂空白读。
〔七〕测定样品中的淀粉,其中淀粉中存在的可溶形式和D-葡萄糖和麦芽糖糊精的存在。1。过滤样品溶液的等分试样,用Whatman1号滤纸〔或用WhatmanGF/A玻璃纤维滤纸如有必要〕。检测使用澄清的滤液。
2。参加2mL的样品溶液进展分析,以一个17毫升的玻璃试管。对此,参加8ml95%V/V
乙醇和大力的旋涡混合器混合。允许在室温下静置30分钟,离心10分钟1800克。
3。倾析上层清液,然后再溶解在1毫升水中含淀粉颗粒。假设有必要,以帮助重溶解在沸水浴中加热管和内容。〔〕试剂1〔100mM的醋酸盐缓冲液,〕,管的原重量的考虑。
4。如有必要,可重复的的乙醇preciptation和离心步骤〔如样品中含有高浓度的D-葡萄糖和/或糊精〕。倾析上层清液,然后再溶解在1毫升水中含淀粉颗粒。假设有必要,加热管和内容,在100℃,以帮助再溶解。〔〕与水的体积,管的原重量的考虑。
5。参加1mL的AMG〔2瓶〕稀释50倍〔〕,在50℃水浴孵育
30分钟。
6。传输重复的等分试样〔〕中的稀释溶液的玻璃试管的底部〔16*100毫米〕。
7。添加3ML的GOPOD试剂,每管〔包括D-葡萄糖监控及试剂空白〕,20分钟,在50℃孵化管。
8。D--葡萄糖标准溶液〔1毫克/毫升〕。。
9。对每个样品的吸光度,和D-葡萄糖掌握在510nm处对试剂空白读。
〔H〕测定酶的抗性淀粉。
此,可以准确测量使用抗性淀粉测定试剂盒〔K-RSTAR〕由Megazyme的供给。得到的结果接近地模拟从Megazyme的网站〔megazyme;K-RSTAR〕获得。这种方法已经成功地经受间评价〔37个试验室,16个样本〕的主持下,AOAC国际〔〕和AACC国际〔推举方法32-40〕
计算〔固体样品〕:
淀粉,%=△A×F×FV/×1/1000×100/W×162/180=△A×F/W×FV×
其中:
△A=吸光度〔反响〕读对试剂空白。
F=100〔Ug的D-葡萄糖〕/吸光率在100Ug的葡萄糖〔Ug的吸光度转换〕
FV=最终体积〔即等于100毫升或10毫升实施例中〔a〕和〔b〕条;
〔四〕,100或10毫升实施例〔五〕。
=分析样本的体积。1/1000=Ug的转换毫克。
100/W=因子表达“淀粉”面粉重量的百分比W=重量的面粉分析毫克〔“原样”的根底上〕
162/180=调整免费D-葡萄糖脱水D-葡萄糖〔发生在淀粉〕.
淀粉,%w/w的〔干重根底〕:=淀粉,%w/w的〔原样〕×100/〔100-含水率〕[%w/w]
声明:
附注:使用Megazyme兆计算值,为固体或液体样品,可下载的从产品上Megazyme的的网站〔megazyme〕的消灭,这些计算可以简化。
我们成认有价值的争论与:争论动物科学家,WL:〔美国农业部农业研
究效劳,麦迪逊,〕在当前更的总淀粉测定过程。
总淀粉〔原样根底〕
表1中。,在该方法中的A-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶在pH5温育进展。
表1
a
样本
一般玉米淀粉
目前的方法〔PH5〕
面粉
高直链玉米淀粉b
ACS可溶性淀粉
化学改性淀粉
燕麦麸
a平均重复分析由两个独立的分析师
b高直链淀粉〔总淀粉价值被低估〕。
表2中。〔DMSO改性〕和当前的改进,其中淀粉溶解在2N
总淀粉〔原样根底〕
马铃薯直链淀粉b
Novelose240c
Hylon VII
氢氧化钾的总淀粉相比,调整pH值,并在pH5的A-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶进展温育。
表2
a
样本
一般玉米淀粉
目前的方法〔KOH/PH5〕
高直链玉米淀粉b
a平均重复分析由两个独立的分析师
b本机的高直链淀粉
C逆行的高直链淀粉
表3中。总淀粉测定程序〔,例如“b和”修改DMSO〕间评价结果。