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口蹄疫病毒通用、a型二重实时荧光定量pcr检测引物及探针的制作方法
本发明提供口蹄疫病毒通用、A型二重实时荧光定量PCR检测引物及探针,所述引物包括P0、P1、P2、P3和P4,所述探针包括P5和P6。本发明基于所述引物和探针建立的二重实时荧光定量PCR检测可实现一个反应同时对口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ3个亚型的通用型和口蹄疫病毒A型进行快速鉴别检测,可在1-2h内完成检测,具有快速、特异、敏感、高通量等优点,能满足大批量、快速鉴别检测口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒的要求。
【专利说明】口蹄疫病毒通用、A型二重实时荧光定量PCR检测引物及探针
【技术领域】
[0001]本发明属于动物疫病检疫检测【技术领域】,具体地说,涉及口蹄疫病毒通用型、A型二重实时荧光定量PCR检测引物及探针。
【背景技术】
[0002]口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)引起的猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、恶性、高度接触性传染病,易
感动物达70多种。该病传播途径多、速度快,曾多次在世界范围内暴发流行,造成巨大政治、经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前,有三分之二的OIE成员国流行FMD,时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫包括7个血清型,中国流行的和受邻国威胁的主要有0、A、AsiaI3个血清型,而各血清型之间的交叉保护力很差。因此,利用简单、快速、准确的检查方法尽早对口蹄疫作出型的鉴别诊断对控制口蹄疫疫情至关重要。实时荧光定量PCR(fluorescentquantitativePCR,简称为FQ-PCR)是一种新型诊断工具,具有敏感、快速、准确的特点,并且在核酸快速扩增的同时实现模板的定量测定。目前发展起来的多联实时荧光PCR技术可以在同一个PCR反应中,通过Tm值分析来区分不同的核酸片段,这为同时检测多种病原提供了技术基础。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测0、A、AsiaI3个血清型口蹄疫病毒通用型和鉴别A型口蹄疫病毒的口蹄疫病毒通用型、A型二重实时荧光定量PCR检测引物及探针。
[0004]本发明的另一目的是提供上述引物及探针在检测口蹄疫病毒和鉴别A型口蹄疫病毒中的应用。
[0005]为了实现本发明目的,本发明提供的口蹄疫病毒通用、
A型二重实时荧光定量PCR(二重FQ-PCR)检测引物及探针,所述引物包括:
[0006]PO:5,-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3,(SEQIDN0:3所示序列);
[0007]Pl:5'-CGGCCTCTCATCCAACAGA-3,(SEQIDN0:4所示序列);
[0008]P2:5,-ATTTTCCTTCAGGCGCTTGA-3,(SEQIDN0:5所示序列);
[0009]P3:5,-AACCCCACCGCCTACCA-3,(SEQIDN0:6所示序列);
[0010]P4:5,-GGTGTAAGGGAGCGCAAGTC-3,(SEQIDN0:7所示序列);
[0011]所述探针包括:
[0012]Probe-P5:5'-F1-TCATTTGTGAAACGCG-Q1-3'(SEQIDN0:8所示的序列5'端连接Fl,3'端连接Ql);
[0013]Probe-P6:5'-F2-AAGCAGCCGTTTACG-Q2-3'(SEQIDN0:9所示的序列5'端连接F2,3'端连接Q2);
[0014]其中,F1、F2为荧光基团,Q1、Q2为非荧光淬灭基团,Fl为FAM,F2为VIC,Q1和Q2为MGB。
[0015]其中,PO为反转录引物,用于对待测病毒样品的总RNA进行反转录获得cDNA;P1、P2、P3、P4和Probe-P5和Probe-P6为实时荧光定量PCR引物及探针。
[0016]本发明还提供含有上述引物及探针的用于实时荧光定量PCR检测口蹄疫病毒通用型和A型口蹄疫病毒的试剂盒。
[0017]其中,在本发明所提供的试剂盒中还可以含有阳性对照品和阴性对照品,阳性对照品可以为〇型、A型和AsiaI型口蹄疫病毒标准株,阴性对照可以为水或其它病毒标准株。
[0018]本发明进一步提供上述引物及探针、或试剂盒在实时荧光定量PCR检测口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒中的应用。所述应用包括以下步骤:
[0019]1)提取待测病毒样品的总RNA,进行反转录获得CDNA;其中,反转录体系为:5XM-MLV缓冲液4μL,,弓丨物POlμL,M-MLV反转录酶0·5μL,,RNAIOyL;反转录条件为:37°C,lh;
[0020]2)将cDNA克隆入pGEM-TEasy载体中,筛选阳性重组质粒,以质粒为模板,进行PCR扩增反应;
[0021]3)分析PCR产物。
[0022]其中,进行PCR扩增反应使用的反应体系以25μ1计为:Pl、P2、P3、P4终浓度各为0·4μmol/L,Probe_P5终浓度为0·6μmol/L,Probe_P6终浓度为0·7μmol/L,,10XExTaq酶缓冲液
,5U/,,补足去离子水至终体积25μL。
[0023]PCR扩增反应条件为:94°C5分钟;94°C15秒,60°C30秒,共40个循环。
[0024]本反应中,需同时做阳性对照和阴性对照,分别设置通用型检测体系和A型检测体系为FAM和VIC荧光通道。
[0025]在本发明中,检测结果的判定方式可以为:阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准,不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线,且Ct值>,,并且无特定的扩增曲线,则判定为阴性;>Ct值>,对可疑样品重新试验,结果为阳性者判定为阳性,结果为阴性者判定为阴性;对可疑样品重新试验,结果再次为可疑者应重新采集该动物样品重新试验。同一份样品判定:通用型检测体系FAM荧光通道和A型VIC荧光通道均为阳性者判定为本样品为T/A型双阳性样品,即该样品为A型口蹄疫感染样品;通用型检测体系FAM荧光通道阳性,A型检测体系VIC荧光通道阴性者判定为本样品为通用型阳性样品,即该样品为其他型口蹄疫感染样品,而非A型口蹄疫感染样品。
[0026]本发明提供的口蹄疫病毒通用型、A型二重实时荧光定量PCR检测引物及探针,以及基于所述引物和探针建立的二重实时荧光定量PCR检测可实现一个反应同时对0、A、AsiaI3个血清型口蹄疫病毒FMDV-T和A型口蹄疫病毒FMDV-A进行快速鉴别检测,可在l-2h内完成检测,具有快速、特异、敏感、高通量等优点,能满足大批量、快速鉴别检测FMDV-T、FMDV-A的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1:通用FMDV重组质粒的鉴定;其中,M为DL2000Marker,1为通用FMDV重组质粒PCR扩增产物,扩增产物为633bp。
[0028]图2:A型FMDV重组质粒的鉴定;其中,M为IOObpMarker,1为A型FMDV重组质粒PCR扩增产物,扩增产物为326bp。
[0029]图3:口蹄疫二重实时荧光定量PCR诊断方法的建立;其中,1为FAM探针FMDV-T扩增曲线,2为VIC探针FMDV-A扩增曲线,3、4为阴性对照。
【具体实施方式】
[0030]以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,
2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0031]实施例1口蹄疫病毒通用、A型二重实时荧光定量PCR检测体系的建立
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]0型、A型和AsiaI型口蹄疫病毒标准株,均购自农业部兰州兽医研究所;其他对照病毒或质粒由河南省动物疫病预防控制中心保存。
[0036]
[0037]荧光PCR仪,美国ABI公司产品,型号ABI7000;PCR扩增仪,德国Biometra公司产品;凝胶成像分析系统,美国AlphaInnotech公司产品;恒温水浴震荡器(HZQ-Q),哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品;台式高速冷冻离心机,美国Heraeus公司产品;ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA回收试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司,pGEM-TEasy载体、JM109感受态细胞购自Promega公司。
[0038]
[0039]
[0040]经大量比对GenBank中FMDV7个血清型的基因和
FMDV-A基因序列,选取FMDV的0、A、AsiaI3个血清型基因高度保守基因序列(SEQIDNO:1)和FMDV-A基因高度保守且具有型特异性基因序列(SEQIDN0:2)为模板设计FMDV-T/FMDV-A的特异性引物对和TaqManMGB探针,分别命名为FMDVR(PO)、FMDV-T(Pl)、FMDV-T(P2)、FMDV-A(P3)、FMDV-A(P4)、FMDV-T-MGB-FAM-Probe(Probe-P5)、FMDV-A-MGB-VIC-Probe(Probe-P6),由宝生物工程(大连)有限公司合成,用于FMDV-T/FMDV-A二重TaqManMGBFQ-PCR扩增的引物和探针序列如下:
[0041]PO:5,-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3,
[0042]Pl=Si-CGGCCTCTCATCCAACAGA-3;
[0043]P2:5;-ATTTTCCTTCAGGCGCTTGA-3;
[0044]P3:5,-AACCCCACCGCCTACCA-3,
[0045]Ρ4:5'-GGTGTAAGGGAGCGCAAGTC-3'
[0046]Probe-P5:5'-FAM-TCATTTGTGAAACGCG-MGB-3'
[0047]Probe-P6:5'-VIC-AAGCAGCCGTTTACG-MGB-3'
[0048]
[0049]模板RNA的制备:以FMDV-T/FMDV-A阳性质粒为阳性对照,水为阴性对照,与0型、A型和AsiaI型口蹄疫病毒标准株同时采用Trizol法提取总RNA。具体操作如下:分别取0型、A型和AsiaI型口蹄疫病毒标准株、,再加入600μL
的Trizol于涡旋器震荡2-3min,加入200μL***仿,离心后,,加200μL异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤沉淀,干燥,最后用20μLDEPC(焦磷酸二乙酯)水溶解沉淀,取10μL用于反转录,其余-20°C保存。
[0050]
[0051]每管FMDV反转录反应体系含如下成份:5XM-MLV缓冲液4μL;(三磷酸脱氧核苷酸)4μL;M-;;引物POlμL;总体积10μL。,37°C水浴Ih或置于PCR仪中37°C反应lh,反应结束后,70°C,15min灭活反转录酶,直接用于后续PCR扩增或-20°C冻存备用。
[0052]-T/FMDV-A标准品的制备
[0053]将FMDV-T/FMDV-A的阳性扩增产物分别克隆入pGEM-TEasy载体中,筛选阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司采用T7和SP6引物进行测序。测序正确的FMDV-T/FMDV-A重组阳性质粒应用分光光度计测定其OD26tl和OD28tl值及OD26tZOD28tl值,共重复5次;参考质粒DNA拷贝数计算方法,计算pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-°拷贝/°拷贝/μL,°?LOXIOiq
拷贝/μL,-20°C保存备用。对通用FMDV重组质粒(pGEM-T/FMDV-T)和A型FMDV重组质粒(pGEM-T/FMDV-A)进行鉴定。(如图1和2,通用FMDV重组质粒的扩增产物为633bp,A型FMDV重组质粒的扩增产物为326bp。)
[0054]-T/FMDV-A二重FQ-PCR反应条件的优化
[0055]-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-,P1/P2、P3/、、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·,Probe-P5、Probe-P6探针分别稀释到终浓度为0·05、0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·,应用荧光PCR仪(美国ABI公司,型号:ΑΒΙ7000)采用矩阵法筛选不同浓度的FMDV-T/FMDV-A引物和探针组合,筛选针对FMDV-T/FMDV-A的二重FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。
[0056]优化的25μLPCR反应体系,FMDV-T/FMDV-A上、下游引物P1/P2、P3/P4终浓度各0·4μmol/L,Probe_P5终浓度为0·6μmol/L,Probe_P6终浓度为0·7μmol/L,,,5U/,,补足去离子水至终体积