文档介绍：（RT-）qRT-PCR
（Reverse transcription） quantitative real time PCR
RT-PCR
Reverse transcription-PCR
Real-time PCR
第一页，共63页。
第二页，共63页。
样品处理
细菌样品
收集1-5*109细菌，置于液氮
研磨，加入1mL Trizon，混匀，高温（55℃）
细胞样品
收集1-5*107细胞，加入1mL Trizol，混匀，进行RNA提取或者放置于-80℃冰箱
动物样品
取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可） mL离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆。
第三页，共63页。
RNA提取及反转录
将处理好的样品置于室温，静置5 min
***仿，振荡15s，静置5 min
4℃离心，12000g×15min，取上清
加入等体积异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min
4℃离心，12000g×10min，弃上清
加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清
晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
第四页，共63页。
RNA提取及逆转录
注意事项
样品量和Trizol的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
实验过程必须严格防止RNase的污染。
DNase （RNase-free）
RRI （Recombination RNase Inhibitor）
第五页，共63页。
第六页，共63页。
RNA提取及逆转录
RNA质量检测（完整性与纯度）
第七页，共63页。
RNA提取及逆转录
反转录注意事项
RT Primer的选择
Oligo dT，随机引物，基因特异性引物
gDNA污染
第八页，共63页。
RNA提取及逆转录
❌
第九页，共63页。
qRT-PCR（实时荧光定量PCR）
第十页，共63页。