口蹄疫病毒感染性互补脱氧核糖核酸及其制备方法.docx

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专利名称:口蹄疫病毒感染性互补脱氧核糖核酸及其制备方法
技术领域:
本发明主要涉及口蹄疫病毒感染性cDNA及其制备方法,特别是O型口蹄疫病毒感染性cDNA及其制备方法、从该感染性cDNA转录的RNA、包含该感染性cDNA的宿主细胞等。
背景技术:
建立感染性cDNA技术已成为现代病毒学研究中最重要的工具之一,该研究工具的发明及应用极大地推动了包括口蹄疫病毒在内的所有RNA病毒的研究进程。因为有了感染性cDNA,我们就可以在DNA分子水平上,应用基因工程技术对RNA病毒进行研究,如通过对病毒基因组进行定点突变以产生特定的突变体病毒,也可以缺失或替换基因组的任意部分以产生突变体。使得我们可以在分子水平上直接观察特定的病毒基因对病毒的复制、毒力及免疫等生物学功能等的影响。另外,从cDNA得到的感染性转录本,也将为研究病毒适应细胞及其致弱的分子基础提供帮助,借此可以制造有效的弱毒疫苗而没有毒力回复的危险,进而为研制新型的FMDV基因工程苗提供一个新的思路。
口蹄疫病毒(Foot-and-Mouthdiseasevirus,FMDV)是一种引起偶蹄动物严重疾病的病毒,由于其常造成严重的经济损失,因而被国际兽疫局
(OIE)列为A类传染病。
目前国外已经有报道成功构建了A型和O型口蹄疫的感染型cDNA,并在此基础上对FMDV进行了许多领域的研究。但口蹄疫的感染型cDNA的构建方法仍然需要改进,并且针对我国流行的毒株(O型)也没有构建感染型cDNA的报道。因此,本领域需要改进的口蹄疫感染型cDNA构建方法和容易构建的有效的口蹄疫感染型cDNA。
发明内容
本发明一方面提供口蹄疫病毒的全长感染性cDNA。特别地,该感染性cDNA包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的poly(A)序列和poly(C)序列,在全长cDNA的5’末端上游具有启动子(优选强启动子,例如T7启动子核心序列),3’末端具有单一的限制性酶切位点以保证转录正确终止。优选地,本发明的全长感染性cDNA与病毒基因组天然序列高度保真。例如,除了启动子、poly(A)序列和poly(C)序列之外,本发明的全长感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过50个核苷酸,例如不超过20个核苷酸,优选不超过15个,更优选不超过10个,更优选不超过8个、7个、6个、5个,甚至更优选不超过4个、3个、2个,最优选不超过1个核苷酸。
在一个优选实施方式中,口蹄疫病毒是O型口蹄疫病毒。
在本发明口蹄疫病毒感染性cDNA另一个优选的实施方式中,
poly(C)结构具有少于35个聚合C,优选不超过32个,更优选不超过30个,更优选18-29个聚合C。
在本发明口蹄疫病毒感染性cDNA另一个优选的实施方式中,poly(C)结构是通过合成poly(C)序列和其侧翼序列,利用至少一个(特别是一个或者两个)FMDV基因组中自然存在的限制性内切酶识别位点而导入全长cDNA中的。
在本发明口蹄疫病毒感染性cDNA另一个优选的实施方式中,poly(C)结构是通过合成poly(C)序列和其侧翼序列,并突变poly(C)侧翼不超过3个核苷酸(优选不超过2个,更优选不超过1个核苷酸)来获得至少一个(特别是一个或者两个)限制性内切酶识别位点,而导入全长cDNA中的。
在本发明口蹄疫病毒感染性cDNA一个具体的实施方式中,poly(C)结构是通过合成poly(C)序列和其侧翼序列,利用FMDV基因组中poly(C)下游自然存在的一个下游限制性内切酶识别位点,并突变poly(C)上游1个核苷酸来获得一个上游限制性内切酶识别位点,而导入全长cDNA中的。
在本发明口蹄疫病毒感染性cDNA的再一个优选实施方式中,poly(A)尾具有18-70个A(包括18-70中间的所有整数),优选具有18-56个A,更优选具有25-50个A,例如36个A。
优选地,本发明感染性cDNA以质粒如pBluescriptSK(-)为载体。
一个特别优选的实施方式是,本发明口蹄疫病毒感染性cDNA
包含SEQIDNO1所示的序列或在严谨条件与该序列杂交的序列。
由于通过突变例如基因缺失技术可以从本发明感染性cDNA制备弱毒株疫苗,因此,本发明另一方面也涉及上述感染性cDNA通过突变例如基因缺失技术而衍生的口蹄疫病毒感染性cDNA。
另一方面,本发明还提供从本发明感染性cDNA转录的感染性RNA。
另一方面,本发明还提供本发明感染性cDNA转化的宿主细胞,包括原核细胞如大肠杆菌细胞,和真核细胞,例如酵母细胞、昆虫细胞动物细胞,尤其是哺乳动物的细胞。优选所述转化是稳定转化。
再一方面,本发明还提供从该宿主细胞产生的病毒颗粒。
另一方面,本发明提供制备口蹄疫病毒感染性cDNA的方法,包括(a)化学合成口蹄疫病毒的poly(C)序列和其侧翼序列;(b)用通过逆转录PCR方法获得口蹄疫病毒基因组其它部分的各片段,其中,应用3’RACE方法扩增基因组的3’末端序列片段,包括poly(A)结构;优选地,(a)和(b)中的所有片段两端都设计适当的限制性酶切位点以便于组装克隆为全长cDNA,更优选地,所有这些限制性酶切位点是通过突变病毒基因组天然序列不超过20个核苷酸(优选不超过15个,更优选不超过10个,更优选不超过8个、7个、6个、5个,甚至更优选不超过
4个、3个、2个,最优选不超过1个核苷酸)或利用天然的限制性酶切位点而获得的;和(c)将所扩增的PCR片段优选采用限制性内切酶克隆方法组装克隆到载体(优选质粒,例如pBluescriptSK(-))中,获得全长克隆cDNA,其中,全长克隆cDNA可操作地与启动子连接,优选地,通过在口蹄疫病毒基因组5’端片断的5’端PCR扩增引物中包含启动子序列或将口蹄疫病毒全长cDNA克隆在载体中启动子下游来给口蹄疫病毒cDNA引入可操作地连接的启动子;全长克隆cDNA3’末端具有单一的限制性酶切位点。
其中,步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行。优选步骤(a)和(b)以高保真的方式进行。高保真PCR的方法是本领域熟知的,包括例如利用高保真Taq酶等,可参见例如Sambrook等,分子克隆实验室手册(MolecularCloningALaboratoryManual),第二版,ColdSpringHarbor,NY,1989。
在本发明方法一个优选的实施方式中,口蹄疫病毒是O型口蹄疫病毒。
在本发明方法再一个优选的实施方式中,poly(C)结构具有少于35个聚合C,优选不超过32个,更优选不超过30个,更优选18-29个聚合C。
在本发明方法再一个优选的实施方式中,poly(C)结构是通过利用至少一个(特别是一个或者两个)FMDV基因组中自然存在的限制性内切酶识别位点而导入全长cDNA中的。
在本发明方法再一个优选的实施方式中,poly(C)结构是通过突变poly(C)侧翼不超过3个核苷酸(优选不超过2个,更优选不超过1个核苷酸)来获得至少一个(特别是一个或者两个)限制性内切酶识别位点,而导入全长cDNA中的。
在本发明方法再一个优选的实施方式中,poly(C)结构是利用FMDV基因组中poly(C)下游自然存在的一个下游限制性内切酶识别位点,并突变poly(C)上游1个核苷酸来获得一个上游限制性内切酶识别位点,而导入全长cDNA中的。
在本发明方法再一个优选的实施方式中,poly(A)尾具有18-70个A(包括18-70中间的所有整数),优选具有18-56个A,更优选具有25-50个A,例如36个A。
在本发明方法再一个优选的实施方式中,本发明方法还包括将本发明的感染性cDNA体外转录和/或检验或验证感染性cDNA是否具有感染性的步骤。
在参考下列详述和附图后,本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。
图1是质粒pBluescriptSK(-)的物理图谱。
图2是从pBlFMDV体外转录产生的RNA的变性凝胶电泳,其中,泳道1体外转录产物;泳道MRNAMarker。
图3是用对照或从pBlFMDV体外转录产生的RNA转染细胞的结果。
图4是实施例中构建的感染性cDNA的全基因序列SEQIDNO1
。
图5是实施例中构建口蹄疫病毒感染性cDNA的技术路线示意图。
具体实施例方式
感染性cDNA构建的基本原理是以病毒的基因组RNA为模板,通过反转录和聚合酶链式扩增反应,得到其全长互补链cDNA,再应用分子克隆技术将其克隆到合适的载体中,该载体要具备能进行体(内)外转录的高效启动子,并能稳定、忠实地增殖病毒基因组cDNA。构建好病毒基因组的全长cDNA以后,利用体内(外)转录系统,对其进行转录反应,得到转录本RNA,再用它转染敏感细胞系,可产生感染性的病毒克隆,最后以其他手段鉴定所产生的病毒的感染性,如果所做的各项鉴定实验都能证实其感染性,就表明我们已经成功得到了具有感染性的cDNA。这样我们就可以在DNA分子水平上,根据研究者的意愿对病毒基因组进行操作,并应用现代分子技术开展许多领域的研究。
构建口蹄疫病毒的感染性cDNA的技术关键有以下几点
1)病毒基因组在分子克隆过程中要确保其真实性;2)要保证所构建的感染性cDNA含有足够长度的尾巴结构,即poly(A)序列。
3)要保证所构建的感染性cDNA含有足够长度的口蹄疫病毒所特有的结构,即poly(C)序列。
4)所构建的感染性cDNA要含有强的启动子,并能使转录反应正确终止。
在一个非常具体的实施方式中,我们所构建的感染性cDNA,是将口蹄疫病毒基因组的全长cDNA克隆到质粒载体pBluescriptSK(-)(Stratagene)中,包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的poly(A)序列和poly(C)序列。在全长cDNA的5’末端上游具有T7启动子,3’末端具有单一的限制性酶切位点以保证转录正确终止。
在该实施方式中,本发明构建感染性cDNA的方法可以按如下进行1)口蹄疫病毒的培养物中抽提口蹄疫病毒基因组RNA;2)用所设计的特异引物进行反转录反应(RT),分为5段(S、L、C、D、E)合成基因组RNA的cDNA第一链;3)首先利用PCR技术,用高保真Taq酶扩增S、L、C、D四个片段。
4)应用3’RACE方法扩增基因组的3’末端序列(E段),包括poly(A)结构。
其具体操作过程是,首先用ERT(-)为反转录引物,以病毒RNA为模板合成cDNA第一链,再用E(+),E(-)为扩增引物,以所合成的cDNA第一链为模板,进行PCR反应,得到含有poly(A)结构的3’末端序列(E片段,在其3’末端由E(-)引入NotI位点)。
5)根据各扩增片段中所含有的酶切位点,首先将E片段克隆到pBluescriptSK(-)(Stratagene)中(所使用的酶切位点为
XbaI和NotI位点),再以此重组质粒为载体,将D片段连到E的上游(所使用的酶切位点为XbaI和BamHI(TakaRa)位点,BamHI由引物D(+)引入),同样再将C片段连接到D的上游((所使用的酶切位点为BglII和HindIII位点,BglII是D和C片段中共有的酶切位点),这样将所扩增的C、D、E段连接在一起,克隆到pBluescriptSK(-)载体中,构建成3’端半分子,命名为X;6)利用定点PCR反应将S片段中的第323位的G突变为T,从而在此产生一个NheI酶切位(GCTAGC),同时在L片段5’端具有一个自然存在的PstI酶切位点,根据这两个酶切位点,我们采取人工合成基因的方法,合成一段基因,其序列为5’-GGATCCGCTAGCCGCCCGCCTGGTGTGCTTCGACTGTCACCCGAAGCCCGCCTTTCAC29AAGTTTTACCGTCGTTCCCGACGTTTAAAGGGAGGAAACCACAAGCCTGCAG-3’,下划线分别为BamHI,NheI(TakaRa)和PstI(TakaRa)识别位点。用BamHI(TakaRa)和PstI消化合成的基因,并将该基因插入用同样的酶处理的pBluescriptSK(-)中,命名为M。
7)以A(+)和A(-)为PCR引物,扩增S片段(在5’端由A(+)引入SpeI,ApaI位点和T7启动子序列,在其3’末端含有NheI位点,由A(-)引入),用L(+)和L(-)扩增L片段(在其5’末端含有PstI位点)。
8)用PstI(TakaRa)和HindIII(TakaRa)分别处理L片段的