文档介绍：该【双相罗氏鉴别或药敏培养基的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【15】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【双相罗氏鉴别或药敏培养基的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。双相罗氏鉴别或药敏培养基的制作方法
专利名称::双相罗氏鉴别或药敏培养基的制作方法
技术领域:
:本发明属医学检测
技术领域:
,涉及双相罗氏鉴别或药敏培养基。具体涉及一种能进行快速鉴定结核分枝杆菌的鉴别培养基或能进行快速药敏试验的结核分枝杆菌药敏培养基及其制备方法。
背景技术:
:结核病是严重危害人类健康的重大传染病。具有关统计报道,目前全球约有l/3的人口感染结核菌,目前患结核病的数人约2000万,每年新发病人数800万1000万,死亡病例数约200万,是其它所有传染病死亡人数的总和。我国的结核病疫情十分严峻,,现有活动性肺结核患者约450万,其中具有传染性的菌阳病人196万,位居世界第二。有关研究显示,我国又是结核病高耐药国家,结核病人耐药率位居全球第二。结核分枝杆菌是结核病的病原菌。由于结核分枝杆菌的快速检测、鉴定和药敏试验对结核病的确诊和治疗用药具有重要的指导作用,因此迫切需要进行快速准确的结核分枝杆菌鉴定和药敏试验。然而,长期以来我国一直釆用固体罗氏培养基法进行结核分枝杆菌的分离培养、鉴定和药敏试验,得到检验结果需时12
月(见中国防痨协会编辑出版的结核病细菌学检验规程——中国教育文化出版社,2006年1月第一版,4649和5256页),目前的检测方法严重滞后于临床诊治的需要,而且,有关的鉴别试剂和药物因在制备培养基过程中因受到加热而被破坏,致使细菌鉴定和药敏检测结果的准确性受到影响。目前,尽管也有建议使用液体培养基方法进行结核分枝杆菌的快速鉴定和药敏试验(见中国防痨协会编辑出版的结核病细菌学检验规程——中国教育文化出版社,2006年1月第一版,3744页和8993页),但因结核分枝杆菌细菌在液体培养基中不形成菌落,因此无法根据菌落特征作出是否为分枝杆菌的初步鉴定。因此必须先取培养液进行涂片、抗酸染色,再在显微镜下进行观察,才能得出液体培养基中生长的细菌是否为抗酸染色阳性的分枝杆菌,结果既费时又费力,仍然达不到快速简便目的。因此,临床和研究实践迫切需要新型快速、简便、准确的结核分枝杆菌鉴别和药敏培养基。
发明内容本发明的目的是针对上述现有技术的各种固体和液体鉴别及药敏培养基存在的缺陷,提供一种双相罗氏鉴别或药敏培养基。本发明培养基能快速、简便、准确的鉴别结核分枝杆菌或进行结核分枝杆菌药敏培养,解决了结核分枝杆菌鉴定和药敏试验需时久、准确性差的问题。本发明的另一目的是提供上述双相罗氏鉴别或药敏培养基的制备方法。本发明采用以下技术方案实现上述目的制备一种既含固体又含液体的营养丰富的分枝杆菌专用的双相罗氏鉴别或药敏培养基,该培养基同时含有固体和液体二种培养基的营养成分,能为分枝杆菌的快速生长提供充足的养料,达到縮短培养时间、提早报告的目的;同时,因为细菌在
该培养基中生长时可在固体表面形成菌落,因此通过观察菌落特征,对生长的细菌作出是否为结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌的初步鉴定;此外,也可挑取单个菌落进行进一步的鉴定。本发明所述的双相罗氏鉴别或药敏培养基由固体培养基和液体培养基所组成,其中,固体培养基部分由如下重量配比的组分组成-、、***、、、、、***、天门冬素l2g、磷酸二氢钾l2g、磷酸二氢钠24g、中性甘油812ml、1%孔雀绿水溶液1020ml,鸡卵液1000ml,无菌蒸馏水600ml;液体培养基部分包括基础液、促生长剂、抑菌剂和鉴别试剂或抗结核药物,其中,(1)、***、、、、、、***、吐温-、、~lg、磷酸二氢钠12g,用蒸馏水溶解;(2)、生物素
,,,,a-,蛋白胨l2g,酪蛋白水解物12g,葡萄糖1020g,牛血清白蛋白v5因子100200g,分枝杆菌培养上清510ml;G)抑菌剂选自氨节青霉素、二性霉素B、多粘菌素B、奈啶***~;(4)鉴别试剂选自噻吩-2-羧酸肼,;或对硝基苯甲酸,;(5)抗结核药物选自异烟肼、利福平、链霉素和乙***丁醇,、、.02mg/ml。通过下述方法和步骤制备双相罗氏鉴别培养基1)分别制备固体和液体培养基;2)吸取液体培养基34ml,加至固体培养基中;3)在上述培养基的液体中分别加入噻吩-2-,制成双相罗氏鉴别培养基;或,4)在上述培养基的液体中分别加入抗结核药物异烟肼、利福平、链霉素和乙***,2ml,制成双相罗氏药敏培养基。使用所述的双相罗氏鉴别培养基的方法如下1)将待鉴定菌株配置成10'2mg/ml;2)-2-羧酸肼、对硝基苯甲酸鉴别培养基和不含鉴别试剂的对照培养管的液体中;3)将上述培养管斜置,3537'C温箱孵育12周;4)每天观察结果一次,如在培养基的液体中出现细菌颗粒和/或在固体表面出现菌落即为细菌生长阳性;5)待检菌株如在噻吩
-2-羧酸肼鉴别培养基中生长,在对硝基苯甲酸鉴别培养基中不生长,则为结核分枝杆菌;如在噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸二种鉴别培养基中均生长,则为非结核分枝杆菌。使用所述的双相罗氏药敏培养基方法如下-1)将待检菌株配制成10—2mg/ml;2);3)将上述培养管斜置,3537X:温箱孵育l2周;4)每天观察结果一次,如在液体培养基中出现细菌颗粒和/或在固体培养基表面出现菌落即为细菌生长阳性;5)如待检菌株在不含药的对照培养基中生长,在含药的培养基中不生长,则该菌株为药物敏感株;如细菌在不含药的对照培养基及含的培养基中均生长,则该菌株为耐药株。采用本发明的鉴别培养基检测200株结核分枝杆菌和200株非结核分枝杆菌,并与常规应用的固体鉴别培养基进行比较。结果显示,本发明培养基较常规培养基鉴定时间提早1723天;鉴别培养基鉴定结果与常规应用的固体鉴别培养基鉴定结果完全相同,符合率100%;污染率低于常规鉴别培养基;采用本发明的药敏培养基对200株结核分枝杆菌临床分离株进行异烟肼、利福平、链霉素和乙***丁醇四个药物的药敏检测,并与常规应用的固体药敏培养基结果进行比较。结果显示,本发明培养基较常规培养基药敏时间提早1416天;与常规应用的固体药敏培养基检测结果符合率为9599%;药物的药敏试验结果符合率分别为异烟肼为
95%,利福平为99%,链霉素为98%,乙***丁醇为96%;本药敏培养基检测结果污染率低于常规固体药敏培养基污染率。具体实施例方式实施例1制备双相罗氏鉴别或药敏培养基1)制备固体培养基(1)、、***、、、、、***、天门冬素12g、磷酸二氢钾12g、磷酸二氢钠24g,蒸馏水600ml,110120'C加热1520分钟,冷却;(2)加入中性甘油812ml、1%孔雀绿水溶液10~20ml,鸡卵液1000ml,充分混匀,分装于无菌培养管内,每管710ml;(3)将培养管斜置于加热器内,8090'C加热1020分钟,冷却后置4'C保存备用;2)制备液体培养基(1)、***、、、、、、***、吐温-、、、磷酸二氢钠l2g,用蒸馏水溶解;(2)加入中性甘油812ml,混匀,加蒸馏水至lOOOml,110120。C加热灭菌1020分钟;(3)冷却后加入l~、,,,过氧化氢酶(,a-,蛋白胨
l2g,酪蛋白水解物l2g,葡萄糖1020g,牛血清白蛋白v5因子100200g,、二性霉素B、多粘菌素B、奈啶***酸和阿洛西林50100吗/ml的蒸馏水溶液充分混匀;3)制备既含固体又含液体的结核分枝杆菌快速生长培养基(1)在上述固体培养基中,每管无菌加入34ml液体培养基,制成既含固体又含液体的结核分枝杆菌快速生长培养基;(2)将上述制备好的结核分枝杆菌快速生长培养基,放置37'C培养24小时进行无菌试验,若无细菌生长即可置4'C保存备用;4)在上述制备好的培养基的液体中,分别加入结核分枝杆菌的鉴别试剂噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸,通过下述步骤制成结核分枝杆菌双相罗氏鉴别培养基(1)准确称取噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸,用二***甲酰***溶解,再用灭菌蒸馏水稀释噻吩-2-~,,无菌抽滤后备用;(2)-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸溶液,无菌加入到上述制得的培养基的液体中,制成双相罗氏鉴别培养基。5)鉴别培养应用试验采用制得的鉴别培养基检测200株结核分枝杆菌和200株非结核分枝杆菌,与常规应用的固体鉴别培养基进行比较。结果显示,本发明的鉴别培养基鉴定时间为37天,而常规应用的固体鉴别培养基需时2130天,本发明培养基较常规培养基鉴定时间提早1723天;鉴定结果完全相同,符合率
100%;%,%。本发明的结核分枝杆菌双相罗氏鉴别培养基可对生长的细菌进行结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的快速菌种鉴定。本发明的鉴别培养基中,由于采用了无菌加入鉴别试剂至制得的培养基的液体中,因此能避免因加热破坏鉴别试剂而导致鉴定结果不准的缺陷,同时能减少鉴别试剂用量,降低了成本。与现有技术的罗氏鉴别培养基比较,其制备过程中,采用先加入鉴别试剂到培养基后,再进行加热灭菌,导致所加入的鉴别试剂受到不同程度的破坏和鉴别试剂用量较大以及鉴定结果准确性低的问题。表1是本双相罗氏鉴别培养基与常规罗氏鉴别培养基检测结果比较。表l_tableseeoriginaldocumentpage106)在上述2)制得的培养基的液体中,分别加入抗结核药物,通过下述步骤制备双相罗氏药敏培养基-(1)准确称取抗结核药物异烟肼、利福平、链霉素和乙***丁醇药粉,除利福平二***甲酰***溶解外,其余用蒸馏水溶解,并用蒸馏水稀释至应用液,无菌抽滤后备用。,,,乙***;(2),无菌加入到所述的制得的培养基的液体中,制成结核分枝杆菌快速药敏培养基。7)药敏培养基应用试验采用本发明的药敏培养基对
200株结核分枝杆菌临床分离株进行异烟肼、利福平、链霉素和乙***丁醇四个药物的药敏检测,并与常规应用的固体药敏培养基结果进行比较。结果显示,本发明的药敏培养基检测时间为714天,而常规应用的固体药敏培养基需时2130天,本发明培养基较常规培养基药敏时间提早1416天;本药敏培养基检测结果与常规应用的固体药敏培养基检测结果符合率为9599%;4个药物的药敏试验结果符合率为异烟肼为95%,利福平为99%,链霉素为98%,乙***丁醇为96%;%,%。本发明所述的药敏培养基可对生长中的结核分枝杆菌进行耐药性的快速检测。本药敏培养基中,采用无菌加入抗结核药物至制得的培养基的液体中,可避免药物因加热破坏而导致药物浓度降低所造成的药敏结果不准确的可能性,同时减少药物用量,降低药敏试验成本。而目前常规使用的固体药敏鉴别培养基,其制备过程中,先将鉴别试剂加入到培养基中,再进行加热灭菌,因此药物受到不同程度的破坏,所以药物使用浓度较大,而且药敏检测结果的准确性受到影响。表2是双相罗氏药敏培养基与常规罗氏药敏培养基检测结果比较。表2tableseeoriginaldocumentpage11实施例2:-2-羧酸肼12mg、对硝基苯甲酸510mg,分别用二***甲酰***溶解,再用灭菌蒸馏水稀释,噻吩
-2-,,无菌抽滤;-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸溶液,无菌加入到制备好的结核分枝杆菌快速生长培养基的液体中,制成双相罗氏鉴别培养基。、、***、、~、枸橼酸钠(、、***、天门冬素12g、磷酸二氢钾12g、磷酸二氢钠24g,用600ml蒸馏水溶解,110120。C加热1020分钟;加入中性甘油812ml、1%孔雀绿水溶液1020ml,鸡卵液1000ml,充分混匀,分装于无菌培养管内,每管710ml;斜置于加热器内,8090匸加热1020分钟;秤取培养基的液体组分:、***、、、、、、***、吐温-、、、磷酸二氢钠l2g,中性甘油812ml,蒸馏水1000ml;溶解、混匀,11012(TC加热灭菌1020分钟;、,,,,a-,蛋白胨12g,酪蛋白水解物12g,葡萄糖