治疗眼病的方法和组合物的制作方法.docx

文档介绍：该【治疗眼病的方法和组合物的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【35】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【治疗眼病的方法和组合物的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。治疗眼病的方法和组合物的制作方法
专利名称:治疗眼病的方法和组合物的制作方法
技术领域:
本发明涉及疾病的治疗,具体涉及治疗眼病的方法和组合物。
背景技术:
在发达国家中,年龄相关的黄斑变性(AMD)是年龄相关性失明的主要原因。其发病率随着寿命延长和老年人口增多而增高(.,ArchOphthalmol122,564(2004))。这是一种慢性疾病,特征在于视网膜中央区域(黄斑)的进行性损坏,引起中央视野视力损失(,,,ProgRetinEyeRes23,229(2004))。AMD的一个关键特征是形成被称为玻璃疣(drusen)的细胞外沉积,其集中在视网膜后面介于视网膜色素上皮细胞(RPE)与脉络膜之间的黄斑中及其周围。迄今,尚未有这种疾病的治疗被证明广泛有效,尤其是对于其晚期形式。若干风险因素与AMD相关,包括年龄、吸烟和家族史(AREDSResearchGroup,Ophthamology107,2224(2000))已进行了候选基因关联性研究和基因组范围连锁扫描来鉴定AMD的遗传风险因子。基于与其它视网膜疾病的关联性或其已知功能,提出了许多候选基因。尽管有些这些基因中的一些稀有变体与疾病表型相关,但未观察到可解释大比例总体发病率的遗传差异
(,,,ProgRetinEyeRes23,229(2004))迫切需要关于AMD遗传决定子的更多信息。
发明内容
本发明涉及鉴定与AMD易感性相关的人基因中的变异,其可用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体,并可用于诊断或辅助诊断AMD。其还涉及鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法,诊断或辅助诊断AMD的方法,用于这些方法中的多核苷酸(如,探针、引物),包含探针或引物的诊断试剂盒,治疗有AMD风险或患有AMD的个体的方法,以及用于治疗有AMD风险或患有AMD的个体的组合物。在一种实施方案中,本发明提供用于检测或辅助检测与人发生AMD相关的CFH基因的多核苷酸,以及在一些具体实施方案中,用于检测或辅助检测与人AMD相关的CFH基因的变异。在另一种实施方案中,本发明提供用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法和组合物。在另一种实施方案中,本发明的方法和组合物可用于治疗患AMD或有发生AMD风险的个体。本公开还提供用于检测来自个体的样品中变体CFH基因的诊断试剂盒。这样的试剂盒可用于鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体,以及用于诊断或辅助诊断个体中的AMD。在一种实施方案中,本发明提供用于检测变体CFH基因的分离多核苷酸;该分离多核苷酸包含特异性检测与人发生AMD相关的
CFH基因中的变异。分离多核苷酸可用于在来自个体的样本中检测与人AMD相关的变体CFH基因。本发明的多核苷酸进一步可用于等位基因-特异性分析(如,本领域已知的等位基因-特异性杂交,引物延伸,或连接分析),从而检测与发生AMD相关的CFH基因变异。等位基因-特异性探针和引物可与一种基因的一种或多种等位基因特异性杂交而不与同一基因的其它等位基因杂交。例如,本发明的等位基因-特异性多核苷酸探针可与变体CFH基因杂交但不与野生型CFH基因杂交。在某些实施方案中,所述分离多核苷酸是在严谨条件下与人发生AMD相关的CFH基因中变异相杂交的探针。在一些具体实施方案中,本发明的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含CFH基因的全部或部分、或其等位基因变体的核酸分子相杂交,其中所述核酸分子包含与人发生AMD相关的变异。在另一些实施方案中,本发明的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含CFH基因的至少10个连续核苷酸、或其等位基因变体的核酸分子相杂交,其中所述核酸分子包含与人发生AMD相关的变异。在另一些实施方案中,所述分离多核苷酸是在严谨条件下与人发生AMD相关的CFH基因变异的邻近、上游或下游相杂交的引物。在某些实施方案中,本发明的分离多核苷酸引物为至少10个核苷酸长度并杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的一侧或另一侧。所述多核苷酸可含有变化形式,比如一个或多个核苷酸替换、增加或缺失,只要它们以相同的特异性程度与其靶标变体
CM基因相杂交。如本文所用,当与核酸连用时,术语“分离”是指已鉴定且与其天然来源中通常相伴的至少一种污染核酸分离开的核酸序列。相反,非分离核酸是以天然存在状态发现的核酸比如DNA和RNA。本文所述多核苷酸(如,多核苷酸探针或多核苷酸引物)可以是DNA或RNA。所述多核苷酸可以是单链或双链的。本发明的多核苷酸探针和引物可以是约5个核苷酸-约3000个核苷酸。在一些实施方案中,本发明的多核苷酸探针和引物为约8个核苷酸-约500个核苷酸。在另一些实施方案中,本发明的多核苷酸探针和引物为约10个核苷酸-约250个核苷酸。在一些实施方案中,本发明的多核苷酸探针和引物为约20个核苷酸(如,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。在另一些实施方案中,所述多核苷酸探针和引物为约50-约100个核苷酸(如,45、50、55、60、65、75、85或100个核苷酸)。所述多核苷酸可包含一个或多个非天然或经修饰的核苷酸。非天然或经修饰的核苷酸包括但不限于放射性标记、荧光标记或化学标记的核苷酸。在某些实施方案中,本发明的多核苷酸引物杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的上游或下游。在一种实施方案中,所述多核苷酸杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的附近。例如,杂交可以以这样的方式发生少于10个核苷酸将变异和邻近该变异的杂交引物末端之间分离开。在另一种实施方案中,杂交以这样的方式发生
1-3个核苷酸将变异和邻近该变异的杂交引物末端之间分离开。在某些其它实施方案中,所述多核苷酸引物杂交至紧邻变异处。在另一种实施方案中,本发明的多核苷酸引物杂交时距与人发生AMD相关的CFH基因变异一定距离(如,至少10个核苷酸)。例如,杂交可以以这样的方式发生邻近变异的杂交引物末端距CFH基因中变异为10、25、50、100、250、1000、5000或高达10,000个核苷酸。本文所述的发明还涉及成对多核苷酸引物,其特异性检测与人发生AMD相关的CFH基因中变异,其中第一多核苷酸引物杂交至该变异的一侧而第二多核苷酸引物杂交至该变异的另一侧。杂交至包含与人发生AMD相关的CFH基因中变异的DNA区域的一对多核苷酸引物可以以这样的方式杂交至该区域邻近变异的杂交引物末端距离约20-约10,000个核苷酸。作为替代,杂交至包含与人发生AMD相关的CFH基因变异的DNA区域的成对多核苷酸引物可以以这样的方式杂交至该区域邻近变异的杂交引物末端距离约100-约7,500个核苷酸,或距离约200-约5,000个核苷酸。在另一种实施方案中,本文所述的发明提供用于区分两种CFH等位基因(例如,野生型等位基因和与人发生AMD相关的等位基因)的三种或更多种多核苷酸引物。第一引物杂交至两种等位基因共同的核苷酸序列,比如与发生AMD相关的CFH基因变异的上游或下游的非等位核苷酸序列。第二引物特异性杂交至第一等位基因独特的序列
(如,与人发生AMD相关的CFH基因变异)。第三引物特异性杂交至第二等位基因独特的序列(如,野生型CFH基因)。三种引物的这种组合引起DNA区域的扩增,这取决于样品中存在何种Cm等位基因。例如,如果CFH基因具有与发生AMD相关的CFH基因变异则扩增一个DNA区域,如果样品中存在野生型CHl基因则扩增另一个区域。作为替代,该组合的两种引物可杂交至CFH基因的两种等位基因共有的核苷酸序列,比如处于与人发生AMD相关的CFH基因变异的上游和下游的非等位核苷酸序列,以及第三引物特异性杂交至CHl基因的两种等位基因之一(比如野生型等位基因或与人发生AMD相关的等位基因)。通过本文所述的方法和组合物可检测使个体易患AMD的许多CFH基因变异。在一个具体实施方案中,该变异在CFH蛋白质第402位处编码组氨酸以外的氨基酸。在一个具体实施方案中,该变异在CFH蛋白质第402位处编码酪氨酸。在另一种实施方案中,该变异在CFH蛋白质第62位处编码缬氨酸以外的氨基酸。在一个具体实施方案中,该变异在CFH蛋白质第62位处编码异亮氨酸。在另一些实施方案中,本文所述的方法和组合物可用于检测使个体易患AMD的CFH基因变异,比如表4、5和7中所列的那些。例如,其它变异基因,比如所述变异位于编码区的那些(例如编码以下的变异在CHl蛋白第58位处编码丝氨酸以外的氨基酸,比如丙氨酸蛋白第
127位处编码精氨酸以外的氨基酸,比如组氨酸;在CFH蛋白第400位处编码谷氨酰***以外的氨基酸,比如赖氨酸;在CFH蛋白质第609位处编码缬氨酸以外的氨基酸,比如异亮氨酸;在CFH蛋白第890位处编码丝氨酸以外的氨基酸,比如异亮氨酸;在CFH蛋白第936位处编码谷氨酸以外的氨基酸,比如天冬氨酸;在〇!1蛋白第1007位处编码缬氨酸以外的氨基酸,比如亮氨酸;在CFH蛋白第1050位处编码天冬酰***以外的氨基酸,比如酪氨酸蛋白第1166位处编码脯氨酸以外的氨基酸,比如谷氨酰***;在CFH蛋白第1210位处编码精氨酸以外的氨基酸,比如半胱氨酸。参见表4、5和7)可使用本文所述方法和组合物进行检测。作为替代,变异在非编码区中的变异基因,t匕如表4、5和7中所列的那些,可使用本文所述的方法和组合物进行检测。如本文所用,术语“变体CFH基因”是指包括与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA。如本文所用,术语“野生型CFHDNA”和“野生型CFH基因”表示不包括与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA。
本发明还涉及在从个体获得的样品中检测与人发生AMD相关的变体CFH基因的方法。这样的方法可包括(a)将样品与多核苷酸探针相组合,所述探针在严谨条件下与与人AMD相关的CFH基因变异杂交,但不与野生型CFH基因(野生型CFHDNA如上所述)杂交;和(b)确定是否发生杂交。发生杂交则指示样品中存在与年龄相关黄斑变性有关的变体
CFH基因。用于本文所述方法中的样品可包含来自以下的细胞眼、耳、鼻、牙、舌、表皮、上皮、血液、泪、唾液、粘液、尿道、尿液、肌肉、软骨、皮肤或从中可获得足够DNA或RNA的任何其它组织或体液。可通过多种收集细胞的方式比如口腔拭子来收集样品。必要时处理样品以提供可用于本文所述方法中进行分析的DNA或RNA。例如,可以处理样品使得来自该样品的DNA可用于扩增或与另一种多核苷酸杂交。所处理的样品可以是粗制裂解物,其中可用的DNA或RNA未从其它细胞物质中纯化,或可以纯化所处理样品以分离可用的DNA或RNA。可使用提供DNA或RNA用于本文所述方法进行分析的本领域已知的任何方式处理样品。处理样品的方法包括但不限于,裂解和/或纯化细胞和细胞裂解物的机械、化学或分子学方式。处理方法例如可包括色谱法比如离子交换(如阳离子和阴离子)、体积排阻、凝胶过滤、亲合以及疏水相互作用色谱,或超滤、电泳、以及使用对所述多肽的特定表位有特异性的抗体进行的免疫亲合纯化。在另一些实施方案中,本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CHl基因的方法,其包括(a)将样品(称为测试样品)与多核苷酸探针相组合,所述探针在严谨条件下与与人发生AMD相关的CFH基因变异杂交,从而产生组合;(b)在严谨杂交条件下维持步骤(a)中所产生的组合;和
(C)将该组合中发生的杂交与对照中的杂交进行比较。在所述组合中但不在对照中发生杂交指示样品中存在与AMD相关的变体CFH基因。在另一实施方案中,在将所述组合中发生的杂交与对照中杂交进行比较时确定杂交程度。对照与测试样品相同并进行与测试样品同样的处理,只是其多核苷酸探针不与与人发生AMD相关的CFH基因变异相结合。作为替代,所述多核苷酸探针仅结合野生型CFH基因。对照可以依次或与上述组合同时进行测试。作为替代,对照的结果可以在上述组合之前或之后的参考测试中确立。用于对照的样品通常与测试样品为相同类型,并进行与测试样品同样的处理,只是其所组合的多核苷酸不与CHl基因中与人发生AMD相关的变异杂交。在另一种实施方案中,本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CHl基因的方法,其包括(a)将样品的第一部分与多核苷酸探针相组合,所述探针在严谨条件下与CHl基因中与人发生AMD相关的变异杂交;(b)将样品的第二部分与多核苷酸探针相组合,所述探针在严谨条件下与野生型CHl基因杂交;和(c)确定是否发生杂交。在第一部分中但不在第二部分中发生杂交指示样品中存在与AMD相关的变体Ci7H基因。在另一实施方案中,本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因的方法,其包括(a)将样品与一对多核苷酸引物相组合,其中第一多核苷酸引物杂交至编码
CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的一侧,第二多核苷酸引物杂交至编码CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的另一侧;(b)扩增样品中的DNA,由此产生扩增的DNA;(c)测序扩增的DNA;和(d)检测DNA中是否存在在CFH蛋白第402位处编码组氨酸以外氨基酸的变异。所述变异的存在指示在样品中检测到与人发生AMD相关的变体CFH基因。在另一种实施方案中,本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因的方法,其包括(a)将样品与一对多核苷酸引物相组合,其中第一多核苷酸引物杂交至编码Cm蛋白第62位氨基酸的DNA的一侧,第二多核苷酸引物杂交至编码Cm蛋白第62位氨基酸的DNA的另一侧;(b)扩增样品中的DNA,由此产生扩增的DNA;(c)测序扩增的DNA;和(d)检测DNA中是否存在在CFH蛋白第62位处编码组氨酸以外氨基酸的变异。所述变异的存在指示在样品中检测到与人发生AMD相关的变体CFH基因。本领域用于扩增核酸的任何已知方法均可用于本文所述方法。例如,样品中的DNA可使用下列方法扩增聚合酶链式反应(00、奶-0、定量?0、实时?0、快速扩增多态性DNA分析、快速扩增cDNA末端(RACE)或滚环扩增。在另一些实施方案中,本发明提供鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体的方法。在一种具体实施方案中,这样的方法包括分析从所述个体获得的样品中是否存在与人发生AMD有关的变体CFH基因。变体CFH基因的存在指示该个体有患