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专利名称::方法和组合物的制作方法
技术领域:
:本发明涉及生产生物学上重要的乙酰化大分子的领域。特别地,本发明涉及将Ne-乙酰-赖氨酸掺入多肽的领域。
背景技术:
:现已将原核生物和真核生物的遗传密码扩展,从而能够在体内对琥珀终止密码子反应位点特异性地掺入20种以上设计的非天然氨基酸。通过赋予生物体改进的正交氨酰tRNA合成酶/tRNAGUA对(aminoacyl-tRNAsynthetase/tRNACUApairs)来完成所述合成遗传密码的扩展,其中所述正交氨酰tRNA合成酶/tRNA。UA对指导对琥珀密码子反应位点特异性地掺入非天然氨基酸。正交氨酰tRNA合成酶用非天然氨基酸使同源的正交tRNA而非其他细胞tRNA进行氨基酰化(aminoacylate);而正交tRNA是正交合成酶的底物,但基本上不被任何内源氨酰tRNA合成酶氨基酰化。使用正交的詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)酪氨酰-tRNA合成酶/RNAota对的改进变体在大肠杆菌()中的遗传密码扩展极大地提高了含非天然氨基酸的蛋白的产量,这是因为与依赖于向细胞或体外翻译反应物中添加按化学计量预氨基酰化的抑制性tRNA的方法相反,正交tRNAraA被其同源氨酰tRNA合成酶催化再酰化,因此氨基酰化不需限制翻译效率。非天然氨基酸突变的很多潜在应用
(包括相应于在蛋白质中多个位点存在的翻译后修饰例如乙酰化的氨基酸翻译掺入)需要更有效的掺入方法,以生产有用量的蛋白。然而,在天然细胞的情况下向蛋白中引入生物物理探针和化学上的精确扰动提供了以此前不能实现的方式理解和控制细胞功能的令人兴奋的可能性。赖氨酸的N、乙酰化是可逆的翻译后修饰,并且在真核细胞中对竞争(rival)磷酸化具有调控作用η4。尚不存在合成在指定位点包含N、乙酰-赖氨酸的蛋白的通用方法。首次描述了在组蛋白上赖氨酸的N、乙酰化21。赖氨酸的乙酰化和脱乙酰化分别由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)介导。近年来,已发现数以百计的真核蛋白(除组蛋白之外)受到乙酰化调控,包括多于20%的线粒体蛋白2°。尽管赖氨酸乙酰化具有巨大的重要性,但是尚没有生产在指定位点包含Ne-乙酰_赖氨酸的均质重组蛋白的通用方法。利用天然化学连接安置Ne-乙酰-赖氨酸的半合成方法被用于证明H4K16在染色质解压实中的作用^这些研究显示了生产均质乙酰化蛋白的方法对我们理解乙酰化在生物学中的分子作用的影响。目前,基于化学的乙酰化方法需要合成大量的修饰肽硫酯,这是一种缺陷。此外,这些已知的方法受到N-末端残基的限制。一些研究者使用纯化的HAT复合体来使重组蛋白乙酰化。然而,这通常是不能令人满意的方案,其原因如下
i)可能尚不知道用于特定修饰的HAT;ii)制备活性HAT复合体通常需要绝妙的技巧;iii)通常难以使得完成HAT介导的反应,从而导致异质的(heterogeneous)样品;和iv)HAT可在多个位点进行乙酰化,从而难以确定在任一位点的分子乙酰化结果。本发明试图克服与现有技术相关的问题。
发明内容赖氨酸的Ne-乙酰化是具有高度生物学重要性的翻译后修饰。在现有技术中,Ne-乙酰化的研究非常困难。用于生产Ne-乙酰化蛋白的现有技术依赖于将Ne-乙酰赖氨酸安置到目标多肽中的化学或半合成方法。这些方法中的一些对技术的要求很高,而另一些方法具有严重的局限性,例如对N-末端残基修饰的限制。已知在现有技术中,没有生产包含Ne-乙酰赖氨酸的均质重组蛋白的通用方法。为了可靠地向多肽中的精确设定位点掺入N、乙酰赖氨酸,本发明的发明人设计了研究细胞中天然存在的多肽合成机制(翻译机制)的方法。特别地,本发明的发明人研发出经修饰而接受Ne-乙酰赖氨酸,并催化Ne-乙酰赖氨酸掺入转运RNA(tRNA)的tRNA合成酶。因此,本发明的发明人创造出此前绝没有被发现的新酶活性。此外,本发明的发明人已经将此新型酶发展成适合的tRNA合成酶/tRNA对,其可用于在合成时以及在操作者选择的位点处将N、乙酰赖氨酸特异地掺入蛋白中。因此,本发明的发明人首次提供了新型tRNA合成酶,以及相应的用于生产掺入了
Ne-乙酰赖氨酸的多肽的新方法。这些新型材料和技术能够生产同质的多肽样品,每个样品均包含所需的翻译后修饰。这无法简单地通过使用基于现有技术中已知技术的现有化学方法而实现。本发明是基于这些显著的发现。因此,一方面,本发明提供了能够结合Ne-乙酰赖氨酸的tRNA合成酶。另一方面,本发明涉及上述tRNA合成酶,其中所述合成酶包含与MbPylRS氨基酸序列具有至少90%序列同一性的多肽。适合地,在至少50个连续氨基酸的范围内评估所述同一性。适合地,在包含对应于MbPylRS的L266至C313氨基酸的区域内评估所述同一性。另一方面,本发明涉及上述tRNA合成酶,其中所述tRNA合成酶多肽包含对应于MbPylRS中至少L266至C313的氨基酸序列的氨基酸序列,或与其具有至少90%同一性的序列。适合地,所述多肽包含相对于野生型MbPylRS序列而言在L266、L270、Y271、L274或C313中的一个或多个位置的突变。适合地,所述至少一个突变(即所述一个或多个突变)在L270、Y271、L274或C313位置。适合地,所述至少一个突变在L270、L274或C313位置。适合地,所述tRNA合成酶包含Y271L。适合地,所述tRNA合成酶包含Y271F。适合地,所述tRNA合成酶包含L266V。适合地,所述tRNA合成酶包含L270I、Y271L、L274A和C313F。适合地,所述tRNA合成酶包含L266V、L270I、Y271F、L274A和C313F。另一方面,本发明涉及包含编码上
述多肽的核苷酸序列的核酸。另一方面,本发明涉及上述多肽在向tRNA负载(Charge)NE-乙酰赖氨酸中的应用。适合地,所述tRNA包含MbtRNAaJS卩,适合地,所述tRNA包含公众可以获得的,由MbPylT基因编码的野生型巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)tRNACUA)。另一方面,本发明涉及制备包含Νε-乙酰赖氨酸的多肽的方法,所述方法包括安排翻译编码所述多肽的RNA,其中所述RNA包含琥珀密码子,其中所述翻译在上述多肽存在下、能够负载有N、乙酰赖氨酸的tRNA存在下、且N、乙酰赖氨酸存在下进行。适合地,所述翻译在脱乙酰化抑制剂存在下进行。适合地,所述抑制剂包含烟酰***(NAM)。另一方面,本发明涉及制备包含N、乙酰赖氨酸的多肽的方法,所述方法包括修饰编码所述多肽的核酸,以在对应于所述多肽中需要掺入N、乙酰赖氨酸的位置的一个或多个位置提供琥珀密码子。适合地,修饰所述核酸包括将编码赖氨酸的密码子突变为琥珀密码子(TAG)。另一方面,本发明涉及包含Νε-乙酰赖氨酸的均质重组蛋白。现有技术中的蛋白在其N、乙酰赖氨酸含量方面是异质的。适合地,所述蛋白由上述方法制备。另一方面,本发明涉及包含上述核酸的载体。适合地,所述载体还包含编码所述tRNA合成酶的tRNA底物的核酸序列。适合地,所述tRNA底物由MbPylT基因(见上文)编码。另一方面,本发明涉及包含上述核酸,或包含上述载体的细胞。另一方面,本发明涉及还包含失活的脱乙酰化酶基因的上述细胞。适合地,所述失活的脱乙酰化酶基因包括缺失或破坏
(disruption)的CobB。另一方面,本发明涉及包含上述载体或包含上述细胞,和一定量烟酰***的试剂盒。另一方面,本发明涉及制备能够结合Ne-乙酰赖氨酸的tRNA合成酶的方法,所述方法包括在L266、L270、Y271、L274或C313中的一个或多个位置突变编码亲本tRNA合成酶的核酸,和选择能够结合Ne-乙酰赖氨酸的一个或多个突变体。具体实施例方式为了解决现有技术中用于合成乙酰化蛋白的方法的缺陷,我们设想通过产生正交Ne-乙酰赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA对,以遗传编码的方式,对琥珀密码子反应高翻译保真且高功效地将Ne-乙酰赖氨酸掺入蛋白中。本文描述了用于通过在大肠杆菌()中对琥珀密码子反应以遗传学方式将N、乙酰赖氨酸掺入从而生产位点特异性乙酰化的重组蛋白的方法和材料。我们还能生产均质的此类蛋白,而这对于现有技术是不可能的。我们证明巴氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(MbPylRS)/MbtRNAcm对15_19在大肠杆菌中成正交,并且与此前报道的有用对具有相当的功效。我们改进了上述对用于对琥珀密码子反应高翻译保真且高功效地掺入N、乙酰赖氨酸。此外,我们还成功地消除了最初观察到的翻译后脱乙酰化。这些策略在破解乙酰化在推测的染色质修饰的表观遗传编码中的作用2’3以及更深入地理解
N、乙酰化的细胞作用2°方面具有广泛的应用。定义应理解,术语“包含”、“包括”、“含有”具有其在本领域的通常含义,即包括所述的特征或特征组,但此术语不排除任何其他的所述特征或特征组的存在。通过复制前体基因(progenitorgene),随后在复制拷贝中获得新功能来改进生物体中分子相互作用的网络。本文描述了人工模拟产生正交分子的自然过程的方法,所述正交分子即这样的分子,其能够与其前体平行地处理信息而没有前体与复制分子之间的串扰。使用这些方法,可以从很多自然命运中选择出复制分子对的进化命运,从而获得复制分子与衍生出所述复制分子的前体分子之间的预定关系。在本文中,其体现于产生能够与野生型tRNA合成酶和tRNA平行地处理信息但没有野生型与正交分子之间串扰的正交tRNA合成酶-正交tRNA。在一些实施方式中,tRNA本身可保持其野生型序列。在这些实施方式中,适合地,在异源背景,即不同于其天然存在的野生型宿主细胞的背景或宿主细胞中,使用保持其野生型序列的所述实体。这样,野生型实体可在功能意义上是正交的,而无需结构上的改变。下文更详细地讨论了正交性及其可接受的标准。巴氏甲烷八叠球菌PylS基因编码MbPylRStRNA合成酶蛋白。巴氏甲烷八叠球菌PylT基因编码MbtRNACUAtRNA。序列同源性/同一性尽管也可将序列同源性视为功能类似性(即具有类似化学性质/功能的氨基酸残基),在本文中,优选通过序列同一性表示同源性。可通过肉眼进行序列比对,但更常借助于可容易获得的序列比对程序进行。这些公用的和可商购的计算机程序能够计算两条或多条序列之间的同源性百分比
(例如,同一性百分比)。可计算连续序列的同一性百分比,即将一条序列与另一条序列比对,且将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的对应氨基酸直接比较,每次比较一个残基。这被称作“无空位”比对。此类无空位比对通常仅在相对较短的残基数量范围(例如小于50个连续氨基酸)内进行。尽管这是非常简单且可靠的方法,但其没有考虑在进行全局比对(在完整序列上进行比对)时,例如在其他方面相同的序列对中,一个插入或缺失将导致随后的氨基酸残基无法比对,这样潜在地导致同源性百分比(同一性百分比)大幅下降。因此,大多数序列比对方法经过设计以产生最佳比对,其考虑可能的插入和缺失,而不是过度地对整体同源性(同一性)进行罚分。这通过在序列比对中插入“空位”以设法使局部同源性/同一性最大化来实现。这些更加复杂的方法为比对中出现的每个空位给出“空位罚分”,这样对于数量相等的相同氨基酸,空位较少的序列比对(反映出两条比较序列之间较高的关联性)所得的分数将高于空位很多的序列比对。“仿射空位罚分”通常用于对空位的存在给出相对高的罚分,而对空位中的每个后续残基给出较小的罚分。这在空位罚分系统中最为常用。显然,高空位罚分将产生空位较少的最佳比对。大多数比对程序允许更改空位罚分。然而,在使用此类软件进行序列比对时,优选使用默认值。例如,在使用
GCGWisconsinBestfit软件包(见下文)时,氨基酸序列的默认空位罚分是空位-12分,而每个延伸_4分。因此,计算最大同源性百分比首选需要在考虑空位罚分的情况下生成最佳比对。适合进行此类比对的计算机程序是GCGWisconsinBestfit软件包(UniversityofWisconsin,;Devereuxetal.,1984,NucleicAcidsResearch12:387)。能够进行序列比对的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包、FASTA(Altschuletal.,1990,-410)和比对工具组GENEW0RKS。尽管就同一性方面可测量最终的同源性百分比,但是比对程序本身通常并不是基于全或无的成对比较。作为替代,通常使用分级的类似性记分矩阵,其基于化学类似性或进化距离给出每个成对比较的分数。此类常用矩阵的实例是BL0SUM62矩阵,其是BLAST程序组的默认矩阵。GCGWisconsin程序通常使用公用的默认值,或者在有提供的情况下使用定制符号比较表格(customsymbolcomparisontable)。对于GCG软件包优选使用公用的默认值,或者在其他软件的情况下,使用如BL0SUM62的默认矩阵。一旦由软件产生最佳比对,即可计算同源性百分比,优选计算序列同一性百分比。软件通常将其作为序列比对的一部分进行,并产生
数值结果。在本文中,同源氨基酸序列是指在氨基酸水平包含至少15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%同一性的氨基酸序列,优选至少95%或98%同一性的氨基酸序列。适合地,使用本文公开的相关多肽序列在至少50或100,优选200、300或更多氨基酸的范围内评估此同一性,最适合地,使用全长前体(亲本)tRNA合成酶序列进行评估。适合地,应考虑那些已知对蛋白功能所必须的区域的一个或多个序列而不是非必须的相邻序列的同源性。这在考虑来自远缘关系生物的同源序列时特别重要。最适合地,至少应在MbPylRS氨基酸序列中从L266至C313的连续区域内,或其他tRNA合成酶的对应区域内评价序列同一性。相同的考虑因素也适用于核酸核苷酸序列,例如tRNA序列。参照序列当使用数字标记指示具体氨基酸残基时,使用MbPylRS(巴氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酰-tRNA合成酶)的氨基酸序列作为参照序列(即,由公知的野生型巴氏甲烷八叠球菌PyIS基因编码)进行编号。本领域充分理解其用于目标残基的定位。这不总是严格的计数工作,还须注意上下文内容。例如,如果目标蛋白的长度略有不同,那么在此序列中对应于(例如)Y271的正确残基的定位可能需要比对序列并选出等价或对应的残基,而不能简单地选择目标序列的第271位残基。这很好地在本领域技术人员的能力范围之内。突变具有其在本领域中的通常含义,并且可以指取代、截短或缺失所涉及的残基、基序或域。突变可在多肽水平上进行,例如通过合成具有突变序列的多肽;或者也可以在核苷酸水平上进行,例如通过制备编码突变序列的核酸,随后翻译所述核酸以产生突变多肽。在没有氨基酸被指定作为给定突变位点的替换氨基酸的情况下,合适地使用所述位点的随机化,例如,如本文中有关本发明的