植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法.docx

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专利名称::植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域:
:本发明涉及一种植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术:
:植物是一个非常脆弱的有机体,很容易受到周围环境的影响,其中温度是影响植物生长发育的最重要因素之一。植物遇到低温冷害会影响到其生长发育的方方面面,包括不能正常发芽、生长缓慢、育性低甚至不结实等。其中有关低温影响发芽以及低温影响育性是近年来研究的热点并已有诸多文章报道。然而,对于低温影响植物生长发育进程的研究却报道甚少。水稻(0ryzasativaL.)是我国最重要的粮食作物,年种植面积占粮食作物的近三分之一,总产占40%左右,对保障我国粮食安全具有极其重要地位。优良水稻品种的选育是确保我国粮食需求的一条重要途径,然而,由于各个地区种植环境的差异,导致了一大批优良的水稻品种不能被广泛的推广,其中低温是影响优良水稻品种向北方推广的最重要限制因素之一。因此克隆控制低温生长的基因具有重要的理论意义与实用价值。水稻控制低温生长的基因大多是数量性状,其分离和克隆非常复杂,而染色体片段置换系(CSSL)或近等基因系
(NIL)是研究水稻数量性状的理想材料。目前,利用近等基因系策略,水稻中已报道一个低温影响发芽的基因,但是有关控制低温生长基因的分离和克隆还未见报道。所有CKI蛋白都具有以下类似的结构,NH2—端含有短的具有9-76个氨基酸残基的NH厂末端区,一个高度保守、具催化功能并在底物识别中有重要作用的约300AA的激酶区,和序列高度可变(13-200AA)且同源性很低的C00N-端延伸区。CKI蛋白的COON-末端区具有几方面的功能,包括决定底物识别的特异性、调节催化活力和/或决定激酶的亚细胞定位及与不同的效应因子相互作用。liu等从水稻cDNA文库中筛选克隆到OsCKIl,发现该基因在水稻根的发育以及植物激素响应两个方面起作用。
发明内容本发明的目的是提供一种植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的植物低温生长相关蛋白(OsCKIl),来源于稻属水稻(Oryzasativa),是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低温生长相关的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由463个氨基酸残基组成。为了使(a)中的OsCKIl便于纯化,可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表l标签的序列标签残基序列
Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)朋朋朋FLAG8DYKDDDDKStr印一tagII8WSHPQFEKc_myc10EQKLISEEDL上述(b)中的OsCKIl可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述(b)中的OsCKIl的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的编码序列得到。编码上述植物低温生长相关蛋白的基因(OsCKIl)也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子;2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子;3)与1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性,且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子。序列表中的序列2由1392个核苷酸组成。(),%SDS的溶液中,在65。C下杂交并洗膜。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域,即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DN***段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到
mRNA前体的3'端,如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子,如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin),它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选择性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体可为将所述基因插入pGA1611质粒的多克隆位点得到的重组质粒。具体来说,所述重组表达载体可为将pGA1611质粒HindIII和Sacl位点间的小片段取代为所述基因
(OsCKIl)得到的重组质粒。含有以上任一所述基因(OsCKIl)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因(OsCKIl)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育温度不敏感转基因水稻的方法。本发明提供的培育温度不敏感转基因水稻的方法,是将所述基因导入目的水稻(如细胞或组织)中,得到温度不敏感的转基因水稻。具体来说,可以将所述重组表达载体导入所述目的植物中,得到温度不敏感的转基因水稻。所述目的水稻具体可为CSSL13水稻;所述温度不敏感具体体现在株高和/或生长速度和/或抽穗期时间性状上。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体,将编码所述蛋白的基因导入植物细胞,可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物,也可以是双子叶植物,如烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明的植物低温生长相关蛋白是首次通过图位克隆的方法分离得到的,将该蛋白导入植物后,可以使植物由低温敏感变为低温不敏感,所以可以将其应用于植物遗传改良等工作,提高植物
(如水稻)对低温的耐受力。如可将该基因导入不耐低温的品种中以提高其耐低温能力,从而用于长江中下游地区早稻和我国北方地区水稻育种。图1为LTG1的初步定位和精细定位;a:LTG1的初步定位;b:LTG1的精细定位;c:交换单株验证。图2为LTG1在自然环境下的表型(左Asominori;右NIL(ltgl));a:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然条件下的生长变化曲线;b:A達inori和NIL(ltgl)在海南自然条件下的生长变化曲线;c:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然条件下的抽穗期表型;d:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然条件下的成熟时的表型;e:Asominori和NIL(ltgl)在海南自然条件下的抽穗期表型;f:Asominori和NIL(ltgl)在海南自然条件下的成熟时的表型。图3为LTG1在不同环境下的抽穗期;E1:南京自然环境;E2:南京人工遮光环境;E3:海南温室环境;E4:海南自然环境。图4为LTG1在人工气候室条件下的表型(左Asominori;右NIL(ltgl));a:Asominori和NIL(ltgl)在高温(28-33度)条件下的苗期表型;b:Asominori和NIL(ltgl)在低温(20-25度)条件下的苗期表型;c:Asominori和NIL(ltgl)在高温和低温条件下的抽穗期。图5为转OsCKIl基因植株的表型(左转OsCKIl基因植株;右转空载体对照植株);a:播种后40天;b:播种后80天。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规
方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。CSSL13水稻中国农业科学院作物科学研究所;KuboT等,,1999,16:104-106;网络链接为http:〃。实施例1、OsCKIl及其编码基因的发现—、水稻控制低温生长基因的遗传分析和初步定位从一套以Asominori为遗传背景携带IR24插入片段的染色体片段置换系(该置换系共66个家系)中发现一个家系CSSL13具有低温敏感表型,该家系在第二染色体长臂上携带IR24插入片段。CSSL13与背景亲本Asominori杂交其Fl表现为Asominori表型,证实对低温敏感的表型是隐性表型。通过调查144个F2植株的分离比,我们发现有36个植株呈现出和CSSL13—样的表型(3:1比例;x2"、InDel标记的开发根据LTG1初定位的结果,从IRGSP(http:〃)下载界定区域已测序克隆的粳稻品种日本晴序列,利用powerblast软件将下载的日本晴序列与已公布的籼稻品种
9311相应的序列进行同源比较,寻找重复次数有差异的或插入缺失4bp以上的序列,然后按10kb左右的距离,。3、dCAPS标记开发dCAPS标记的开发与分析对已确定的SNP位点,(htto:〃),通过错配1到2个碱基设计5'端引物,引物长度约24-30个碱基,然后沿着3'端方向,在大约150-200bp左右的位置设计3'端引物。PCR扩增产物用合适的酶酶切后在8X的非变性聚丙烯酰***凝胶上电泳分析。总共设计了8对有多态SSR、Indel和dCAPs标记(表2)dCAPS标记分析的PCR反应体系DNA(20ng/ul)2ul,Primerl(10pmol/ul)2ul,Primer2(10pmol/ul)2ul,10xBuffer(MgCl2free)2ul,dNTP(10mM),MgCl2(25mM),rTaq(5u/ul),ddH204lOul,总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行94。C3min;94。C30sec,55°C(引物不同,有所调整)45sec,72",35个循环;72。C5min。PCR产物纯化回收,按试剂盒(北京Tiangen公司)步骤进行。PCR产物酶切消化过夜后,用8%的非变性PAGE胶分离,银染。根据F2:3群体中极端隐性家系的分子数据和表型数据,将LTG1定位于标记dCAPSl和indl4之间约
,结果如图1所示。图1中,a为初步定位的结果,b为精细定位结果,横线下方数字表示各个标记与LTG1基因位点间的交换家系数,c为重组家系的表型和基因型。三、植物控制低温生长相关蛋白(OsCKIl)及其编码基因的获得根据定位的位点设计引物primerl和primer2。primerl:5'-GTggatccATGGAGCATGTGATCGGG-3,(下划线所示的序列为BamHI酶识别位点);primer2:5'-TTgagctcTTATTTCCTTCTGTCAGCACT_3,(下划线所示的序列为Sacl酶识别位点)。以primerl和primer2为引物,以Asominori(购自中国农业科学院种质资源库;购买得到,原始来源不清)的cDNA为模板,进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行94。C3min;94。C30sec,58°C30sec,72。,35个循环;72。C7min。将PCR产物回收纯化。用限制性内切酶BamHI和Sacl酶切PCR产物,然后连接入pMD18_T(购自大连宝生物有限公司),连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(购自北京Tiangen公司),挑选阳性克隆后,提质粒进行测序。序列测定结果表明,PCR反应获得的片段具有序列表中序列2所示的核苷酸序列,编码463个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的序列1)。将序列l所示的蛋白命名为OsCKIl,将序列1所示的蛋白的编码基因命名OsCKIl,将含有OsCKIl的pMD18-T命名为pMD18-0sCKI1。实施例2、转基因植物的获得和鉴定
—、重组表达载体构建将实施例1的步骤三构建的pMD18-0sCKI1用HindIII和Sacl双酶切,回收含OsCKIl基因的片段,连接到经HindIII和Sacl双酶切处理的pGA1611载体(uniprotNo:245199,网络链接为http:〃;)上,得到重组表达载体。将重组表达载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。提取质粒进行酶切和测序检测,检测结果表明,获得了含有0sCKIl基因的重组质粒,将其命名为pGA1611-0sCKIl(骨架载体为pGA1611,在HindIII和Sacl位点间插入了序列2所示的OsCKIl基因)。二、重组农杆菌的获得用电击法将pGA1611-0sCKI1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国INVITROGEN公司),得到重组菌株,提取质粒进行PCR及酶切鉴定。PCR鉴定用引物primer3:5'-ATGGAGCATGTGATCGGG-3';primer45,-TTATTTCCTTCTGTCAGCACT3,;。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pGA1611-0sCKI1。三、转基因植物的获得(1)28t:培养EH-pGA1611-0sCKI116小时,收集菌体,并稀释到含有100iimol/L卡那霉素的N6液体培养基(Sigma公司,C1416)中至浓度为0D6。。",获得菌液;(2)将培养至一个月的CSSL13水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min,滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基,