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专利名称::植物发育相关蛋白及其编码基因和应用的制作方法
技术领域:
:本发明涉及一种植物发育相关蛋白及其编码基因和应用。
背景技术:
:理想的株型是水稻提高产量的决定因素。在水稻的理想株型中,半矮化和叶片直立是两个对增产非常有利的性状(WangYandLiJ,.2008,.,59:253-279)。绿色革命就是通过改良水稻株型提高水稻产量的成功例证。近年的一些研究表明叶片直立也是成就水稻高产株型的目标之一。叶片直立可提高冠层光合速率,改善群体下部光照,增加物质生产量;同时增加冠层基部光量,增强根系活力,提高抗倒性;且利于密植,提高单位土地面积上的净光合速率。研究表明油菜素内酯(BRs)影响着水稻的许多重要农艺性状,如株高、叶片角度、分蘖角度、种子形态等(YamamuroCetal.,2000PlantCell12:1591-1605;HongZetal.,2005,PlantCell17:2243-2254;TanabeSetal.,2005,PlantCelll7:776-790;Wangetal.,2008,PLoSONE3:e3521)。尤其是最近对BRs突变体的研究表明通过密植具有直立叶片的水稻品种可以达到增产的目的(MorinakaYetal.,2006,
PlantPhysiol141:924-931;SakamotoTetal.,2006,NatBiotechnol24:105-109),所以人们推测水稻BRs信号途径的关键基因或BRs合成途径的关键酶是改良水稻株型的潜在分子工具。—个成功的例子是通过突变0sDWARF4基因,它编码水稻BRs合成途径的关键酶,获得了叶片直立而育性正常的水稻品种,密植这种水稻品种可以提高水稻产量(Sakamotoetal.,2006)。这使人们对通过调控BRs途径关键基因,改良水稻株型、提高水稻产量的策略信心倍增。迄今为止,人们分离到的水稻BRs信号途径的关键基因有0sBRI1,0sBZRl和0sBIN2,其中人们对0sBRI1的突变体在水稻增产方面的应用进行了详细的研究。研究表明由于OsBRIl是水稻的BRs受体,它在水稻BRs信号途径的核心作用使得它突变后很难找到弱突变体。人们在筛选了100多个突变体后,找到了0sBRI1的弱突变体d61-7,虽然该突变体密植可以增加水稻的生物量,但因为d61-7结小种子所以并没有带来产量的增加。
发明内容本发明的目的是提供一种植物发育相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白(0sIBPl),来自粳稻日本晴(),是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列3的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物发育相关的由其衍生的蛋白质;所述植物发育体现在成株的株高和
/或叶夹角大小和/或成株的育性和/或特定器官的大小等性状上。为了使(a)中的0sIBPl便于纯化,可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列tableseeoriginaldocumentpage4上述(b)中的OsIBPl可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述(b)中的OsIBPl的编码基因可通过将序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的编码序列得到。所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述蛋白的编码基因(OsIBPl)可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子;2)序列表中序列5所示的DNA分子;3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA分子;4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC,%SDS的溶液中,在65°C下杂交,然后用2XSSC,%SDS和1XSSC,%SDS各洗膜一次。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有OsIBPl基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可
用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域,即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DN***段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端,如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用OsIBPl构建重组植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子,如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin),它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选择性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为将所述
0sIBPl基因插入pSN1301的多克隆位点得到的重组表达载体。所述质粒pSN1301是将质粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位点间插入35S-Noster序列得到的;所述35S-Noster序列是用限制性内切酶EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切质粒pUC19-35S-Noster得到的;所述质粒pUC19-35S-Noster是将质粒pUC19-Noster的HindiII和BamHI酶切位点间插入35S启动子片段得到的;所述35S启动子片段是用限制性内切酶Hindi11和BamHI双酶切质粒pBI221得到的;所述质粒pUC19-Noster是将质粒pUC19的SacI和EcoRI酶切位点间插入NosterpolyA终止序列得到的;所述NosterpolyA终止序列是用限制性内切酶SacI和EcoRI双酶切质粒pBI221得到的。本发明还保护一种培育转基因植物的方法,是将所述基因导入目的植物中,得到转基因植物。所述转基因植物可为与目的植物相比成株株高变矮和/或叶夹角变小和/或育性降低和/或特定器官变小的转基因植物。所述特定器官变小,具体可为叶宽变小、叶枕部位细胞变小、叶柄縮短、叶片变小等。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体,将本发明所提供的0sIBP1基因导入植物细胞,可获得成株株高变矮和/或叶夹角变小和/或育性降低和/或特定器官变小的转基因细胞系及转基因植株。携带有0sIBPl基因的表达载体可通过使用
Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可为单子叶植物或双子叶植物,如禾本科植物水稻(如日本晴水稻)或拟南芥(Columbia拟南芥)。所述方法中,具体可将所述重组表达载体导入所述目的植物中,得到转基因植物。本发明发现了一个新蛋白0sIBPl及其编码基因0sIBPl。0sIBPl可以与OsILIl相互作用并功能拮抗,因此两个基因可以同时使用达到控制对生长的促进或抑制。用组织特异性启动子可以特异性的控制特定器官(包括营养和有性***官)的生长和大小。本发明还获得了含有该编码基因0sIBPl的重组表达载体,用重组载体转化目的植物,可以得到成株株高变矮和/或叶夹角变小和/或育性降低和/或特定器官变小的转基因植物。因此OsIBPl可以作为一种潜在的分子育种工具,改良植物株型,提高植物产量。图1为实施例1中ilil-D突变体植株和日本晴(WT)幼苗期的照片。5图2为实施例1中ilil-D突变体植株和日本晴(WT)分蘖期的照片。图3为实施例1中种植于大田的扬花期的ilil-D和日本晴(WT)的旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角测量数据统计结果。图4为实施例1中ilil-D突变体植株和日本晴(WT)幼苗叶枕部位近轴面细胞扫描电镜的照片。图5为实施例1中ilil-D突变体植株和日本晴(WT)对外源施加表油菜素内脂敏感性的分析;
A为ilil-D突变体植株和日本晴(WT)叶枕部位弯曲对表油菜素内脂敏感性的分析,其中横坐标轴表示24-印iBL的浓度(nM),纵坐标为水稻叶枕部位弯曲的角度(°);B为ilil-D突变体植株和日本晴(WT)胚芽鞘伸长对表油菜素内脂敏感性的分析,其中横坐标轴表示24-印iBL的浓度(nM),纵坐标为水稻胚芽鞘的长度(cm)。图6为实施例1中ilil-D突变体植株和日本晴(WT)中BRs的含量,其中实心方形代表野生型水稻,实心圆形代表的是ilil-D突变体,数值代表野生型及ilil-D突变体内BRs的含量(ng/g鲜重)。图7为实施例1中ilil-D突变体、日本晴(WT)、ilil-D突变体转化RNAi载体的转基因阳性植株R2和R5的表型和OsILIl的表达量;A:阳性转基因植株的表型;B:实时定量PCR检测OsILIl在转基因植株中的相对表达量。图8为实施例1中实时定量PCR的方法检测OsILIl在植物激素24-印iBL、2,4_D、KT、GA3处理3小时后的相对表达量。图9为实施例1中实时定量PCR的方法检测用24-印iBL终浓度为1yM的水溶液分别处理水稻日本晴幼苗15分钟,30分钟,45分钟,60分钟,120分钟,360分钟后,OsILIl的相对表达量。图10为实施例1中实时定量PCR检测野生型水稻日本晴的种子、穗、根、茎干、叶片、叶枕及叶鞘部位中OsILIl的相对表达量。图11为实施例2中OsILIl和OsIBPl相互作用的实验结果;A:酵母双杂交检测OsILIl和
OsIBPl在体外的相互作用;B:烟草体内OsILIl-YFP和OsIBPl-myc免疫共沉淀的结果。图12为实施例2中实时定量PCR的方法检测用24-印iBL终浓度为1yM的水溶液分别处理水稻日本晴幼苗15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟、360分钟后,OsIBPl的相对表达量。图13为实施例2中实时定量PCR检测野生型水稻日本晴的种子、穗、根、茎干、叶片、叶枕及叶鞘部位中OsIBPl的相对表达量。图14为实施例2中染色质免疫共沉淀检测转录因子OsBZRl与OsIBPl启动子的结合,其中附图上方为基因结构的示意图,白色方框表示启动子区域,黑色方框表示编码区域,黑色圆形表示预测的BR相应元件(BRRE)。图15为实施例3中0sIBPl过表达植株(12#和14#)和日本晴(control)的表型、叶枕部位、OsIBPl的表达量和叶夹角统计数据;A:0sIBPl过表达植株和日本晴的表型;B:叶夹角部位的放大图;C:实时定量PCR检测OsIBPl的相对表达量;D:0sIBPl过表达植株和日本晴叶夹角的统计数据;E:0sIBPl过表达植株和日本晴叶片宽度的统计数据。图16为实施例3中显微镜下OsIBPl过表达植株(12#)和日本晴(control)的叶枕部位的细胞照片。图17为实施例4中0sIBPl过表达植株(2#、4#和5#)和Columbia拟南芥(WT)的表型和OsIBPl的表达量;A-C阳性转基因植株的表型;D:实时定量PCR检测OsIBPl在转基因植株中的相对表达量。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。日本晴水稻中国科学院植物研究所;毛建军,,杨秀芬,曾洪梅,袁京京,邱德文
.水稻品种日本晴粳稻组培培养基的筛选及转稻瘟菌蛋白激发子基因植株的获得.《农业生物技术学报》,2008年16巻5期,824-830;原始来源不清。Columbia拟南芥(拟南芥Columbia):中国科学院植物研究所;刘俊,蔡平钟,马林,张志雄,向跃武,王闵霞,《西南农业学报》,2009年22巻2期,428-432。农杆菌EHA105:中国科学院植物研究所;肖媛,李落叶,徐孟亮,崔延春,.《农业现代化研究》.-368。农杆菌GV3101:中国科学院植物研究所;郑银英,崔百明,常明进,《西北植物学报》-79。实施例中所用的培养基如下NBD2:N6盐分和维生素,500mg/L水解酪蛋白,30g/L蔗糖,2mg/L2,4-D,,。NBD2-S1:NBD2,25mg/L潮霉素(Hygromycine),600mg/L头孢霉素,。NBD2-S2:NBD2,50mg/L潮霉素(Hygromycine),300mg/L头孢霉素,。AAM-AS:AAS盐分和氨基酸,MS
维生素,10Omol/L乙酰丁香***,。NBD2C:NBD2,10g/L葡萄糖,10Omol/L乙酰丁香***,。分化培养基MS盐分和维生素,300mg/L水解酪蛋白,50mg/L潮霉素,3mg/L6-BA,,,,MS维生素,lmg/L多效唑,,,。以下实施例中的基因表达量检测结果,如无特殊说明,均是以野生型植株的目的基因表达量为1,其它植株的目的基因表达量与野生型植株的目的基因表达量进行比较。实施例1、OsILIl的发现—、突变体植株ilil-D的获得和形态观察1、突变体植株ilil-D的获得构建日本晴水稻T-DNA插入突变体库,从中发现了一个叶夹角明显增大的突变体植株ilil-D。2、突变体植株ilil-D的形态观察对突变体植株ilil-D进行如下形态观察。(1)叶夹角i1il-D最重要的表型是在其各个生长时期,均表现为叶夹角明显增大。在幼苗期,突变体萌发后生长5天左右,在第二叶发育完全后就可观察到第二叶叶夹角弯曲已超过90度(见图1)。在分蘖期,突变体的每个新生分蘖都表现为叶夹角明显增大(见图2)。对种植于大田的扬花期的日本晴及ilil-D的旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角进行测量,统计结果表明野生型旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角大小主要集中在0-30°之间,而突变体的叶夹角则主要分布于90-150°之间(见图3)。[OO川(2)种子长度分别检测100粒日本晴种子和