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新的酶、酶组合物及其用途
本发明提供了编码来自金黄色破囊壶菌和Sphaeroformaarctica的新的脂肪酸去饱和酶、KCS、KCR和/或LACS的核酸分子。本发明还提供了含有所述核酸分子的重组表达载体、已经向其中引入表达载体的宿主细胞,和用于大规模产生长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA),例如ARA、EPA和DHA和用于筛选δ-4去饱和酶的方法。
【专利说明】新的酶、酶组合物及其用途
[0001]本申请要求保护申请号为US61/,其全部并入作为参考。
[0002]本发明原则上涉及重组制造脂肪酸的领域。其提供编码溶血磷脂-辅酶A合酶(LACS)、去饱和酶、延伸酶和延伸酶组分的核酸分子。本发明还提供含有去饱和酶、KCS、KCR和/或LACS核酸分子的重组表达载体、已经向其中引入了表达载体的宿主细胞,和用于大规模产生长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA),例如花生四烯酸(ARA,《-6不饱和脂肪酸)、二十碳五烯酸(EPA,《-3不饱和脂肪酸)和/或二十二碳五烯酸(DHA,《-3不饱和脂肪酸)的方法。
[0003]脂肪酸是具有长链烃侧基的羧酸,其在许多生物过程中起主要作用。很少发现脂肪酸在自然中是游离的,而是作为脂类的主要成分以酯化形式存在。因此,脂类/脂肪酸是
能量的来源(例如,b_氧化)。此外,脂类/脂肪酸是细胞膜的组成部分,并因而是处理生物学或生物化学信息所不可缺少的。
[0004]脂肪酸可以分为两类:单个碳键形成的饱和脂肪酸和含有一个或多个顺式构型的碳双键的不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸由属于非血红素-铁酶种类的末端去饱和酶产生。每种这样的酶都是电子转运系统的一部分,所述电子转运系统含有两种其他蛋白,即细胞色素匕和NADH-细胞色素b5还原酶。尤其是,此类酶例如通过催化脂肪酸的氧依赖性脱氢来催化脂肪酸分子的碳原子之间双键的形成(Sperling等,2003)。人和其他哺乳动物具有有限范围的为形成不饱和脂肪酸中特定双键所需要的去饱和酶并且因此具有合成必需脂肪酸,例如,长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)的有限能力。因此,人们不得不通过其膳食摄取某些脂肪酸。此类必需脂肪酸包括例如亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。相反,昆虫、微生物和植物能够合成种类多得多的不饱和脂肪酸及它们的衍生物。的确,脂肪酸的生物合成是植物和微生物的一项主要活动。
[0005]长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA),如二十二碳六烯酸(DHA,22:6(4,7,10,13,16,19))是哺乳动物中多种组织和器官(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的必需组分。例如,脑磷脂中超过30%的脂肪酸是22:6(11-3)和
20:4(11-6)(Crawford,.,等,(1997):1032S-1041S)。在视网膜中,DHA占据视杆外区(光受体细胞的光敏部分)多于60%的总脂肪酸(Giusto,?,等(2000):315-391)。临床研究已经显示,DHA对婴儿中脑的生长和发育和***中正常脑功能的维持是至关重要的(Martinetz,M.(1992):S129-S138)。DHA还对参与信号转导过程的光受体功能、视紫红质激活和视杆与视锥发育具有显著的影响(Giusto,?,等(2000):315-391)。此外,还发现DHA对疾病如高血压、关节炎、动脉粥样硬化、抑郁、血栓形成和癌症的一些积极影响(Horrocks,,.(1999):211-215)。因而,脂肪酸的适当膳食供给对人健康是重要的。因为此类脂肪酸不能通过婴儿、幼儿和老年人有效合成,所以从膳食中充分摄取这些脂肪酸对于这些个体是特别重要的(Spector,.(1999)Lipids34:S1-S3)。
[0006]目前,DHA的主要来源是来自鱼类和藻类的油。鱼油是这种脂肪酸的主要和传统来源,然而,它到销售时一般已被氧化。此外,鱼油的供给是高度不定的,特别鉴于鱼群正在缩减。此外,油的藻类来源因低产量和高提取成本而昂贵。
[0007]LCPUFA的生物合成和LCPUFA掺入到膜脂或甘油三酯通过多条代谢途径进行(Abbadi2001,EuropeanJournalofLipidScience&Technology103:106-113)
。在细菌如弧菌(Vibrio),和微藻类,如裂殖壶菌(Schizochytrium)中,丙二酰-CoA通过LCPUFA产生聚***合酶转化成LCPUFA(Metz2001,Science293:290-293;W000/42195;TO98/27203;W098/55625)。在微藻类,如褐指藻(Phaeodactylum),和苔藓,如剑叶藓(Physcomitrella)中,不饱和脂肪酸如亚油酸或亚麻酸在多个去饱和以及延伸步骤中转化以产生LCPUFA(Zank2000,BiochemicalSocietyTransactions28:654-658)。去饱和发生在结合辅酶A(酰基-CoA)的酰基基团或膜脂的酰基基团上,而延伸在生物化学上受限于结合CoA的酰基链。在哺乳动物中,除去饱和以及延伸步骤外,DHA的生物合成包括通过氧化的链缩短。在微生物和低等植物中,LCPUFA仅仅以膜脂的形式存在(如在剑叶藓和褐指藻的情况下),或以膜脂和甘油三酯的形式存在(如在裂殖壶菌和被孢霉(Mortierella)的情况下)。LCPUFA向脂类和油中的掺入,以及脂肪酸部分(酰基基团)在脂类和其他分子种类如酰基-CoA之间的转移由多种转移酶,如酰基转移酶和转酰基酶催化。已知这些酶进行饱和与不饱和脂肪酸的掺入或交换(Slabas2001,:505-513,Frentzen1998,Fett/Lipid100:161-166,Casesl998,:13018-13023,Lu等2009,
第106卷:44号:18837-18842)。具有三种不同酶活性的一组酰基转移酶是"Kennedy途径"的酶,其定位在内质网(ER)的膜系统的胞质面。微粒体部分中的ER结合的酰基转移酶使用酰基-CoA作为脂肪酸的活性形式。甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化在甘油-3-磷酸的sn-1位置上掺入酰基基团。1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(也称为溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT))催化在溶血磷脂酸(LPA)的sn-2位置上掺入酰基基团。通过磷脂酸磷酸酶(PAP)对磷脂酸去磷酸化后,二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)催化在二酰基甘油的sn-3位置上掺入酰基基团。除了所述Kennedy途径的酶,直接参与TAG生物合成的其他酶是磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT),其是将酰基基团从膜脂的sn-2位置上转移到二酰甘油的sn-3位置上的酶;二酰甘油二酰甘油转移酶(DDAT),其是将酰基基团从一个二酰甘油-分子的sn-2位置上转移到另一个二酰甘油-分子的sn-3位置上的酶,和磷脂酰胆碱:二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(PDCT),其是将极性phosphatodyclcholine头部基团从多不饱和磷脂(例如含有18:2n-6或18:3n-3)的sn-3位置上转移到饱和(例如含有18:0)或单不饱和(例如,含有18:ln-9)二酰基甘油溶血磷脂酰基转移酶(LPLAT)的sn-3位置上的酶,代表能够将活化的酰基基团从酰基-CoA掺入到膜脂中,并还可能催化反向反应的一类酰基转移酶。更尤其是,LPLATs可以具有如溶血磷脂酰乙醇***酰基转移酶(
LPEAT)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)的活性。其他酶,如卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)也可以参与酰基基团从膜脂转移到甘油三酯。一般地,细胞中的脂肪酸结合为硫酯。这些硫酯从游离脂肪酸的形成通过溶血磷脂辅酶A合酶(LACS)的作用发生。
[0008]EPA和ARA二者均是S(d)5必需脂肪酸。它们形***和动物的独特种类的食物和饲料成分。EPA属于酰基链中具有5个双键的n-3系列。EPA发现于海产品中并且在来自北大西洋的多油鱼类中丰富。ARA属于具有4个双键的n-6系列。与EPA中存在的那些性能相比,在《-3位置上缺少双键赋予ARA不同的性能。从AA产生的类花生酸类具有强大的炎症和血小板聚集性能,而来自EPA的那些类花生酸类具有抗炎和抗血小板聚集性能。ARA可以从一些食物如肉、鱼和蛋类获得,但是浓度低。
[0009]亚麻酸(GLA)是发现于哺乳动物中的另一种必需脂肪酸。GLA是极长链n-6脂肪酸和多种活性分子的代谢中间体。在哺乳动物中,长链多不饱和脂肪酸的形成受A6去饱和作用限速。已经显示许多生理学和病理学状况如老化、应激、糖尿病、湿疹和一些感染抑制A6去饱和步骤。此外,GLA因氧化和与某些病症(例如,癌症或炎症)相关的快速细胞分裂而易于分解代谢。因而,膳食补充GLA可以降低这些病症的风险。临床研究已经显示,膳食补充GLA在治疗一些病理学状况如特应性湿疹、经前期综合征、糖尿病、高胆固醇
血症、炎性疾病和心血管疾病中有效。
[0010]虽然生物技术为产生特定的脂肪酸提供了有吸引力的途径,但是现有技术不能提供用于大规模产生不饱和脂肪酸的有效手段。因此,需要产生不饱和脂肪酸,如DHA、EPA和ARA的改进和有效方法。
[0011]由于DHA是特别重要的多不饱和脂肪酸,高度需要这种脂肪酸的有效产生。在DHA产生中特别重要的步骤是S-4去饱和步骤。该步骤通过S-4去饱和酶进行。这些酶利用结合ACP、CoA或在磷脂中的二十二碳五烯酸(DPA,22:5S7,10,13,16,19)作为底物,产生结合ACP、C〇A或在磷脂中的各DHA。DPA又由S-5延伸酶产生。一般地,这些延伸酶延长酰基-CoA脂肪酸。已经观察到,如果使用与延伸过程中使用的那些结合相同骨架的脂肪酸作为底物的去饱和酶,那么可以极大地增加去饱和效率。尤其是,已经显示通过提供酰基-c〇A去饱和酶增加去饱和效率Oomergue等,,483-490)。
[0012]因此需要当与S-5延伸酶配对时具有高去饱和效率的S-4去饱和酶。迄今为止,已知此类去饱和酶仅来自Pavlova/Rebecca物种(Uniprot标识Q6VPV2_PAVLU和A0PJ29_9EUKA,推测也是D6NST0_9EUKA)。这使得其难以筛选当与S-5延伸酶配对时具有高去饱和效率的其他去饱和酶,由于
Pavlova/Rebecca的3-4去饱和酶的相似性,不可能确定这些去饱和酶中保守的氨基酸是否为其功能所需,或它们被保留是否仅因为没有经历足够的时间来产生其他突变。
[0013]本发明人现在提供了当与异源s-5延伸酶配对时具有高去饱和效率的S-4去饱和酶。该S-4去饱和酶与上文提及的Pavlova/Rebecca去饱和酶具有非常低的序列同一性。本发明因此也提供了S-4去饱和酶的可允许突变列表,从而仅很少这些突变会消除S-4去饱和酶本身活性或当与S-5延伸酶配对时的高去饱和效率。因此,本发明提供用于筛选当与异源S-5延伸酶配对时具有高去饱和效率的其他S-4去饱和酶的方法。
[0014]发明详沭
[0015]尤其是,、86或85任一个的氨基酸序列具有至少60%,优选至少69%,甚至更优选至少74%并甚至更优选至少81%的序列同一'丨生的S-4去饱和酶,其中所述序列优选还包含
[0016]-选自"KHPGG"、"QHPGG"或"RHPGG"的基序,优选选自"KHPGGD"、"QHPGGD"或"RHPGGD"的基序,和
[0017]-选自"GLNIQHDANHG"或"HVVGHH"的基序,优选选自"AAIGLNIQHDANHG"或"QHVVGHH"的基序。
[0018]特别令人惊奇的是,可以提供当与异源s-5去饱和酶配对时具有高去饱和效率
的s-4去饱和酶,其与上文提及的Pavlova/Rebecca的S-4去饱和酶具有如此低的序列同一性。还特别令人惊奇的是,在Pavlova/Rebecca中保守的基序"EHPGG"中,第一个氨基酸G(其是酸性氨基酸)可以被K(其是碱性氨基酸)替换,而不消除高去饱和效率。因此可以推断,令人惊奇的还有"QHPGG"和"RHPGG"是替代"EHPGG"的有效基序。同样,令人惊奇的是,在Pavlova/Rebecca中保守的基序"HVVMHH"中,S-4去饱和酶可以被"HVVGHH"替换,疏水性甲硫氨酸M被不起眼的甘氨酸G替换。并且令人惊:奇的是,保守Pavlova/Rebecca基序"EHVVMHH"的第一个氨基酸E可以被Q替换,再次将酸性氨基酸交换成非酸性氨基酸。没有预料到的是,当与异源S-5延伸酶比较时,保守基序中氨基酸性质的这种显著改变是可能的而不消除去饱和效率。
[0019]本发明的S-4去饱和酶至少包含以下保守序列基序,其中"X"表示任何氨基酸:"册66"、"〇腿166"、"如61^"、"〇1￡冊1^卩1?"和"161^1〇冊父順6"。如图2的比对中所示,这些序列为S-4去饱和酶活性所需。
[0020]优选地,本发明的S-4去饱和酶包含至少5个,更优选至少6个,甚至更优选至少7个并且最优选所有以下保守序列基序,其中"X"表示任何氨基酸:"DH)XK"、"HPGG"、"NGGLNXQIEHHLFPR"、"GYXQDWIGG"、"IGLNIQHDANHG"、"YLXFFF"
、"HVVXHHXH"和"FXGXDAT"。这些较长的保守序列基序也发现于如图2中所示的Sphaeroforma、Pavlova或Rebecca属的S-4去饱和酶中。
[0021]更优选地,本发明的S-4去饱和酶包含至少5个,更优选至少6个,甚至更优选至少7个,甚至更优选至少8个,甚至更优选至少9个,甚至更优选至少10个,甚至更优选至少11个,甚至更优选至少12个,甚至更优选至少13个,甚至更优选至少14个并最优选所有以下保守序列基序:"DPD[VILMATQ]K"、"HPGG"、"NGGLN[FWY]QIEHHLFPR"、"GY[ASGM]QDWIGG"、"Y[FI]LP"、"IGLNIQHDANHG"、"YL[AG]FFF"、"HW[GNASKDWM]HH[LIFT]H"、"AP[PA]S"、"F[WF][AVCGSPI]R"、"F[GP]G[RQ]DAT"、"T[LIMVFCA][LIVCA]C"、"P[LF][WA]L"、"KA[CA]A"和"I[VL][GADE]D[GA]"。在该列表中,"X"再次表示任何氨基酸。括号中的氨基酸列表表明,从列表成员中选择的一个成员存在于基序的相应位置上,其中每个单独的列表以降低优选性排序。例如,基序"PLWL"优于基序"PLAL"或"PFWL"或"PFAL",并且这4个基序之一必须存在于本发明更优选的S-4去饱和酶中。在如图2中所示的Sphaeroforma、Pavlova或Rebecca属的3-4去饱和酶中没有发现列表中的一些氨基酸。然而,根据本发明,这些新的氨基酸与Sphaeroforma、Pavlova或Rebecca属的5-4去饱和酶中相应位置上发现的那些氨基酸充分地相似,从而所述新的氨基酸一般不消除或严重降低