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专利名称:人β分泌酶、抑制剂、其组合物和用途的制作方法
技术领域:
本发明涉及β分泌酶(β-secretase)的多种活性形式的发现,β分泌酶是一种在产生β淀粉状蛋白多肽(Aβ)所必需的两个切割位点之一上切割β淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的酶。本发明还涉及该酶的抑制剂,这些抑制剂被认为是治疗淀粉状蛋白产生性疾病(amyloidogenicdisease)如早老性痴呆的候选治疗剂。本发明的其他方面包括用于发现这类治疗性抑制剂的筛选方法、测定法和试剂盒,以及用于确定个体是否携带该酶的突变形式的诊断方法。
背景技术:
早老性痴呆的特征在于,在脑中,特别是在参与记忆和认知的脑部区域中,存在众多淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结(neurofrillatorytangle)。β淀粉状蛋白多肽(Aβ)是一具有39-43个氨基酸的肽,它是淀粉样蛋白斑的主要成分,通过在一种大蛋白即β淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的N末端区域中的特定位点上切割该蛋白而产生。对APP的正常加工涉及在β-AP区域距N末端16-17位氨基酸的C端切割该蛋白、释放所分泌的一胞外结构域——α-sAPP,由此阻止β-AP的产生。通过由β分泌酶在Met671和Asp672之间切割APP
及随后在APP的C末端加工,产生Aβ肽,该肽在阿耳茨海默氏病的病因学中占有重要的位置(Seubert等,早老性痴呆的药理学治疗(PharmacologicalTreatmentofAlzheimer’sdisease),Wiley-liss,Inc.,345-366页,1997;Zhao,,生物化学杂志(.)27131407-31411,1996)。
并不清楚β分泌酶在早老性痴呆患者中的水平和/或活性是否自然高于正常情况;但清楚的是,其切割产物Aβ肽在这些患者脑中存在的淀粉样蛋白斑中却异常地浓集。因此,为了有助于回答这一问题和其他关于该疾病病因学的问题,可取的是将致病性地切割APP的酶分离、纯化和表征。特别是,将经分离的酶或其活性片段用于根据抑制β分泌酶活性的能力筛选候选化合物的方法,也是人们所希望的。期望对β分泌酶活性有抑制作用的药物可用作治疗早老性痴呆和其他以含原纤维Aβ肽的沉积为特征的淀粉状蛋白产生性疾病的有效治疗剂。
美国专利5744346(Chrysler等)描述以大小(当通过凝胶排阻层析测量时,表观分子量在260-300kD的范围内)和酶活性(能在第596和597位氨基酸之间切割具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白同种型)为特征的β分泌酶的初始分离和部分纯化。在β分泌酶的纯度方面,通过提供比在先公开的β分泌酶纯至少200倍的纯化的β分泌酶,本发明提供了显著的进步。这一纯化的蛋白有多种用途,包括结晶用于结构测定。本发明还提供用于产生其大小和酶分布情形与天然存在的形式相同的
β分泌酶重组形式的方法。本发明进一步发现,人β分泌酶是所谓的“天冬氨酰基”(或“天冬氨酸”)蛋白酶。
发明概述本发明涉及目前已经得到纯化具有表观同质性的一β分泌酶蛋白,特别涉及一纯化的蛋白,其特征在于,在典型β分泌酶测定法——MBP-×105nM/h/μg蛋白、×105nM/h/μg蛋白的比活性。所得的酶的特征性活性在于它能在第596和597位氨基酸之间切割具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白(β-APP)同种型,与来自人293细胞(如早已表征过的那些人293细胞)的溶液化的但未富集的膜级分所表现出的活性相比,该酶的比活性高至少10000倍,优选至少20000倍,更优选多于200000倍。
在一实施方式中,纯化的酶在长度上少于450个氨基酸,包括具有氨基酸序列SEQIDNO70[63-452]的多肽。在优选的实施方式中,纯化的蛋白以相对于如SEQIDNO2[1-501]所示的本文称之为酶原的各种“截短的形式”存在,例如具有氨基酸序列SEQIDNO70[63-452]、SEQIDNO69[63-501]、SEQIDNO67[58-501]、SEQIDNO68[58-452]、SEQIDNO58[46-452]、SEQIDNO74[22-452]、SEQIDNO58[46-452]。更一般的是,已发现,该酶特别有用的形式的特征在于,
N末端在SEQIDNO2的第46位上且C末端在SEQIDNO2的第452位和第470位之间,更特别是,N末端在SEQIDNO2的第22位上且C末端在SEQIDNO2的第452位和第470位之间,特别是用于本文所述的结晶学研究时。这些形式被认为在跨膜“锚”域中被切割。其他特别有用的该酶的纯化形式包括SEQIDNO43[46-501]、SEQIDNO66[22-501]和SEQIDNO2[1-501]。更一般的是,现在认识到的是该酶的有用形式的N末端残基对应于选自SEQIDNO2的22、46、58和63位残基中的一个残基,其C末端选自位于SEQIDNO2的452-501位之间或者位于SEQIDNO2的452-470位之间的一个残基。本文还描述了自小鼠分离的酶的形式,如SEQIDNO65所示。
本发明进一步涉及从纯化的β分泌酶蛋白形成的结晶蛋白组合物,例如上述多种蛋白组合物。根据一实施方式,纯化的蛋白的特征在于与β分泌酶抑制剂底物P10-P4’staD→V结合的能力,其至少等于具有氨基酸序列SEQIDNO70[46-419]的蛋白当在同样条件下测试与所述底物的结合时所显示出的能力。根据另一实施方式,形成结晶组合物的纯化的蛋白的特征在于与β分泌酶抑制剂底物SEQIDNO72(P10-P4’staV→V)的结合亲合性,该亲合性至少是具有氨基酸序列SEQIDNO43[46-501]的蛋白当在同样条件下测试与所述底物的结合时所显示出的亲合性的1/100。形成结晶组合物的蛋白可以是糖基化的或脱糖基化的。
本发明还包括含有β分泌酶底物或抑制剂分子的结晶蛋白组合物,所述抑制剂的例子在本文中提供,具体的例子为由肽衍生的抑制剂,例如SEQIDNO78、SEQIDNO72、SEQIDNO81及其衍生物。一般用于这方面的抑制剂具有不大于约50μM-。
本发明的另一方面涉及一个经分离的蛋白,包括一多肽,其(i)长度少于约450个氨基酸残基,(ii)包括一个与SEQIDNO75[63-423](包括其保守替换物)至少90%相同的氨基酸序列,和(iii)表现出β分泌酶活性,该活性由其切割底物的能力所证明,所述底物选自在596-597位氨基酸之间被切割的具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白(βAPP)同种型、MBP-C125wt和MBP-C125sw。满足这些标准的肽包括(但不限于)包括序列SEQIDNO75[63-423]的多肽,例如SEQIDNO58[46-452]、SEQIDNO58[46-452]、SEQIDNO58[46-452]、SEQIDNO74[22-452],也可包括这些序列的保守替换物。
根据另一实施方式,本发明包括经分离的蛋白组合物,如上述的那些,其与β分泌酶底物或抑制剂分子结合,例如MBP-C125wt、MBP-C125sw、APP、APPsw和其可被β分泌酶切割的片段。在本发明的说明书中具体描述了用于这方面的附加的可被β分泌酶切割的片段。特别有用的抑制剂包括衍生自或包括
SEQIDNO78、SEQIDNO81和SEQIDNO72的肽。通常,这些抑制剂具有小于约1μM的Ki。这些抑制剂可被标记上一可测的报告分子。这样的标记分子是特别有用的,例如,用于配体结合测定中。
根据另一个方面,本发明包括蛋白组合物,例如上述的那些,其由异种细胞所表达。根据另一实施方式,这类细胞可共表达β分泌酶底物或抑制剂蛋白或肽。这两种被表达的分子之一或二者均可以与所述细胞来自不同的种。
在一有关的实施方式中,本发明包括与包括一多肽的β分泌酶蛋白特异性结合的抗体,所述多肽包括一个与SEQIDNO75[63-423](包括其保守替换物)至少90%相同的氨基酸序列,但该氨基酸序列缺乏与具有选自SEQIDNO2[1-501]和SEQIDNO43[46-501]的序列的蛋白的显著免疫反应性。
在另一有关的实施方式中,本发明包括经分离的核酸,其包括编码β分泌酶蛋白的核苷酸序列或其互补序列,所述β分泌酶蛋白与选自SEQIDNO66[22-501]、SEQIDNO43[46-501]、SEQIDNO57[1-419]、SEQIDNO74[22-452]、SEQIDNO58[46-452]、SEQIDNO59[1-452]、SEQIDNO60[1-420]、SEQIDNO67[58-501]、SEQIDNO68[58-452]、SEQIDNO69[63-501]、SEQIDNO70[63-452]、SEQIDNO75[63-423]和SEQIDNO71[46-419]的蛋白至少95%相同。明确被排除在该核苷酸之外的是编码具有序列SEQIDNO2[1-501]的蛋白的核酸。
本发明还包括含有经分离的核酸的表达载体,所述核酸可操作地与具有调控序列的核酸连接,所述调控序列对于所述核酸在所选宿主细胞中的表达是有效的,以便进行异种表达。宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或酵母细胞。这些细胞可用于例如产生重组β分泌酶的方法,其中该方法进一步包括将来自所述细胞的提取物或培养介质置于亲合基质上,例如由β分泌酶抑制剂分子或抗体形成的基质,这正如本文所述。
本发明还涉及抑制Aβ产生的化合物的筛选方法,包括使β分泌酶多肽如全长的或上述截短形式的那些多肽接触(i)测试化合物和(ii)β分泌酶底物,和如果β分泌酶多肽在测试化合物的存在下比在测试化合物的不存在下表现出较小的β分泌酶活性,则选择该测试化合物,因为其能抑制Aβ的产生。这一测定可以是基于细胞的,并使用细胞(如上述共表达细胞)所产生的酶和底物中的一种或二者均使用。用于此筛选方法的试剂盒也构成本发明的一部分。
筛选方法可进一步包括将测试化合物给药至患有早老性痴呆或早老性痴呆样病状的哺乳动物对象,并且如果在给药之后,该给药对象维持或改善认知能力或者给药对象表现出蛋白斑负荷减小,则选择该化合物作为候选治疗剂。正如本说明书中所例举的,这一给药对象优选包括针对人β淀粉状蛋
白前体蛋白(β-APP)的转基因,例如是携带编码人β-APP(包括其突变型变体)的转基因的小鼠。
在一有关的实施方式中,本发明包括根据上述方法选择的β分泌酶抑制剂化合物。这些化合物可以选自例如噬菌体展示选择系统(“文库”),例如本领域所公知的那些。根据另一方面,这样的文库可以是“偏向”于序列肽SEQIDNO97[P10-P4’D→V]的。其他抑制剂包括或可源于本文所鉴定的肽抑制剂,例如抑制剂SEQIDNO78、SEQIDNO72、SEQIDNO78和SEQIDNO81。
剔除小鼠也构成本发明的一部分,其特征在于内源β分泌酶基因的失活或缺失,该基因例如是与序列SEQIDNO65至少有90%序列同一性的蛋白的编码基因。所述缺失或失活可以是可诱导的,例如通过将Cre-lox表达系统插入到小鼠基因组中而诱导。
根据另一有关方面,本发明包括有效用于治疗早老性痴呆或其他以Aβ沉积为特征的脑血管淀粉样变性的药物的筛选方法。根据本发明的这一方面,向以β-APP的超量表达和/或Aβ沉积为特征的哺乳动物对象给予一测试化合物,根据该化合物抑制权利要求37所述的β分泌酶蛋白的β分泌酶活性的能力而得以选择。如果该化合物降低所述受治对象中Aβ沉积的量或者维持或改善受治对象的认知能力,则将它选作潜在的治疗性药物化合物。根据一个优选的实施方式,所述哺乳动物对象是携带编码人
β-APP或其突变型的转基因的转基因小鼠。
本发明还包括一种治疗患有或易患早老性痴呆或其他脑血管淀粉样变性的患者的方法。根据这方面,通过向患者给予药学有效量的有效抑制本文所述多种酶形式中的一种或多种的化合物,阻断APP向Aβ的酶水解过程。根据另一特征,治疗性化合物是从选自SEQIDNO72、SEQIDNO78、SEQIDNO81和SEQIDNO97的肽衍生的。采用本文所述的各种噬菌体选择系统,并辅以本发明的筛选方法或其他这样的方法,可实现该衍生过程。另外,还可经合理的化学方法包括药物化学领域所公知的分子模型制作来实现衍生。所述化合物优选是相当强的β分泌酶酶活性抑制剂,这一点可由在MBP-C125sw测定中KI小于约1-50μM来证实。这样的化合物还形成本发明治疗性药物组合物的基础,该组合物也可包括药学有效的赋形剂。
根据又一有关的方面,本发明包括一种诊断患者患有或易患早老性痴呆的方法。该方法包括测定来自所述患者的细胞样品中包括编码β分泌酶的核酸的基因的表达水平,并且如果所述表达水平显著大于预定的对照表达水平,则诊断患者患有或易患早老性痴呆。本文详细描述了可用于该测定的可测核酸和引物。该核酸可以不包括编码前酶原[1-501]的核酸。本发明进一步涉及诊断患者患有或易患早老性痴呆的方法,包括测量来自所述患者的细胞样品中
β分泌酶的酶活性,和如果所述酶活性水平显著大于预定的对照活性水平,则诊断患者患有或易患早老性痴呆。该诊断方法可在完整细胞的测定中和/或在源自所述患者的细胞样品的核酸上进行。
本发明还包括纯化β分泌酶蛋白酶分子的方法。根据这一方面,不纯的含有β分泌酶活性的样品用亲合基质进行纯化,该基质包括β分泌酶抑制剂,例如本文所述的多种抑制剂分子。
在阅读了以下对本发明的详细描述以及参阅了附图之后,本发明的这些和其他目的和特征将变得非常明显。
附图简述
图1A显示编码图2A所示的人β分泌酶翻译产物的多核苷酸序列(SEQIDNO1)。
图1B显示包括推定的5’-和3’-非翻译区的
图1A的多核苷酸(SEQIDNO44)。
图2A显示
图1A和1B所示多核苷酸序列的读码框的预测翻译产物的氨基酸序列(SEQIDNO2)[1-501]。
图2B显示人β分泌酶的活性片段的氨基酸序列(SEQIDNO43)[46-501]。
图3A显示在C末端包括FLAG-表位标记(用下划线标出;SEQIDNO45)