新型小分子重组毒素GnRH-luffinS2融合蛋白及其制备和应用的制作方法.docx

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专利名称:新型小分子重组***GnRH-luffinS2融合蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种抗肿瘤的重组细胞***,尤其是涉及人促性腺激素释放激素(GnRH或LHRH)、luffinS2的靶向***融合蛋白及其制备方法。
背景技术:
肿瘤目前的治疗方案主要以外科手术为主,以化疗和放疗为辅,但是由于这种治疗方法对肿瘤杀伤的特异性较差,因此存在着较大的毒副作用,如骨髓抑制、消化道反应、免疫功能降低、皮肤和粘膜损害、脏器毒性等。所以肿瘤的导向治疗成为肿瘤治疗的研究热点之一。肿瘤的导向治疗是指借助高度特异的亲肿瘤物质作为载体,以细胞毒性作用的物质为"弹头",依靠载体对肿瘤特异的亲和力,将弹头物质尽量集中于肿瘤细胞处,发挥杀肿瘤作用,而对宿主无毒害作用。免疫***即是一种抗肿瘤的导向性药物,它是由生物来源的毒蛋白和抗肿瘤抗体或肿瘤细胞表面受体的配基偶联而成,其机理是以抗体或配基为载体,把***定向带到病灶部位,杀死肿瘤细胞,而很少伤害正常组织。人促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRHorleuteinizinghormonereleasinghormone,LHRH)
是——禾中小分子活性欣(仅10个氨基酸残基),是由下丘脑分泌,通过门脉系统以脉冲的方式分泌至垂体前叶,再通过分布在垂体前叶表面的GnRH受体,作用于腺垂体的促性腺激素细胞,促使其分泌牲腺生成繳素(LH)和促卵泡激素(FSH),LH和FSH再作用于性腺,从而发挥对性腺功能的调节作用。人们在脊椎动物中发现了两种主要的GnRH,他们的氨基酸组成不同,GnRHI的一级结构为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,GnRHII的一级结构为pGlu-His-Trp_Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2。两种型别GnRH的受体在组织中的分布存在较大差异,GnRHI的受体主要分布在垂体中和少数生殖系统组织中,而GnRHII受体则广泛分布在几乎所有的器官组织中。大量的文献和实验表明,Gn朋I型受体在某些肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和子宫内膜癌上呈特异性分布,可以作为肿瘤的一种特异性标志。LuffinS2是熊长云等从丝瓜籽中分离到的一种核糖体失活蛋白(ribosomeinactivatingproteins,RIPs),其含有66个氨基酸,分子量为8KD左右。luffinS2具有较高的RNAN-糖苷酶活性,是目前所知小分子RIPs中毒性较强的,—'"mol/L,它能够水解真核细胞核糖体的28srRNA的N-C糖苷键,使60s大亚基不可逆的失活,从而抑止蛋白质的合成。免疫***的构建有两种方法,一种为化学偶联
法,但是该方法存在以下缺点难以准确控制巯基化的定位和程度,从而可能产生异源性分子;***与配体的随机连接,容易发生受体和配体的空间阻碍;产量低,必须制备和纯化大量的蛋白用于偶联,花费高。另一种方法为基因重组法,该方法克服了化学偶联的不足,近年来得到越来越多的应用。具体方法为将***分子与耙向分子通过一段连接多肽(Linker)构建为重组***,为了方便纯化,常带有能与金属鳌合柱结合的His标签,为了避免His标签引起人体免疫反应,最后要用酶将其切去。Linker设计的正确与否对重组免疫***两部分活性的发挥非常重要,Linker要有一定的长度以保证两边的蛋白分子不会在空间上彼此影响,另外Linker氨基酸如果选择不当,容易带高静电,难以保证理想的效果。发明内容本发明为克服传统的肿瘤治疗药物副作用大,有效剂量高等缺点,克服化学偶联法制备靶向***易产生异源性分子、产量低和代价高昂的不足,克服常规耙向***免疫原性强,对实体瘤的穿透力弱等缺陷,利用GnRH为靶向分子,luffinS2为细胞***,通过设计适当的连接肽,构建一种抗肿瘤的靶向***。本发明是通过如下技术方案来实现的采用基因工程的方法,构建一种靶向***融合蛋白,其包括luffinS2氨基酸片断、人促性腺激素释放激素的氨基酸片断以及位于两者之间的中间连接肽序列。其中,所述的luffinS2氨基酸片断包含luffinS2
全部的氨基酸残基。所述的人促性腺激素释放激素的氨基酸片断为N端的焦谷氨酸被谷氨酰***取代的I型GnRH。所述的中间连接肽序列由3-6个甘氨酸或丝氨酸组成,即由Gly-Gly-Gly-Gly-Ser组成。本发明耙向***)重叠PCR法扩增包含luffinS2、GnRH和Linker的目的片断,利用Codon软件包设计6条重叠PCR引物,引物中添加酶切位点;2)上述重叠PCR产物酶切后回收目的片断,然后连接转入表达质粒。)上述得到的质粒转入大肠杆菌,在适宜的培养条件下表达;2)离心收集菌体,超声裂解后经洗涤得到包涵体;3)裂解包涵体,然后依次经透析复性、金属亲和层析、试剂盒切除His标签并除去蛋白酶后得到纯化蛋白;-luffinS2加入表达Gn朋受体的Hela细胞中培养,镜下观察到随时间的延长,细胞开始出现脱落、病变和坏死。而加入luffinS2天然蛋白的Hela细胞生长正常,表明特异性的GnRH受体是靶向***发挥细胞毒作用的中间环节。XTT染色表明,靶向***GnRH-luffinS2对Hela细胞的半数抑制浓度为15nM,作用于细胞72h后,对细胞的生长抑制作用呈现出较明显的剂量反应关系(图4)。本发明所得到的靶向***的靶细胞为表达I型GnRH受体的癌细胞,如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等,I型GnRH为定向载体,可以产生选择性的细胞毒性效果。将***与GnRH
构建为一条多肽单链,可以避免产生异源性分子,在大肠杆菌中高效表达并降低生产成本。***分子的选择方面,由于luffinS2具有分子量小,细胞毒性强的特点,因此在临床应用时能以较低的***剂量,较低的免疫原性获得对实体瘤较好治疗效果。
图1为pQE30/GnRH-luffinS2载体的构建过程图2为重组靶向***在￡6bh'中表达的SDS-PAGE图谱1耙向***表达载体2蛋白分子量标准3空载体对照图3为表达产物的WesternBlot分析结果16XHistagged单克隆抗体的WesternBlot分析2蛋白分子量标准图4为XTT显色法测定GnRH-luffinS2对Hela细胞的特异性细胞毒作用具体实施方式
实施例1GnRH-luffinS2重组片断的PCR扩增利用Codon软件包设计6条重叠PCR引物,采用重叠PCR扩增GnRH-luffinS2片断,在第一条引物和最后一条引物两端分别加入BamHI和HindIII酶切位点,。实施例2GnRH-luffinS2扩增片断与表达载体pQE-30的连接分别以BamHI和HindIII酶切GnRH-luffinS2和pQE-30,分别回收,连接得到pQE/GnRH-luffinS2,。实施例3融合基因的表达转入大肠杆菌M15中表达,具体条件为将含表达质粒的大肠杆菌菌种接种至LB培养基中,37t震摇过夜,次日按l:100
接种新鲜LB培养基,37。C震摇至OD,=,加入诱导剂IPTG,,于37。C继续震摇5小时,诱导产生GnRH-luffinS2融合蛋白,。实施例4融合蛋白的纯化1)表达菌液5000rpm4"C离心10分钟,弃上清;2)超声裂解沉淀,分别加入TrisCl,PBS,3M盐酸胍洗涤包涵体;3)按lg:10ml加入8M尿素溶解包涵体,室温放置2小时;4)10000rpra离心10分钟,取上清;5)以2M尿素+50mMTrisCl()+lmMGSH+10mMGSSG复性体系复性,4。C复性24小时;6)()透析24小时;7)以M-NTA对复性产物纯化,最后用试剂盒切除His标签并清除蛋白酶。(A)长度60bp;(B)类型核酸;(C)链性单链;(D)(A)长度60bp;(B)类型核酸;(C)链性单链;(D)(A)长度60bp;(B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形分子类型寡核苷酸序列描述
(A)长度60bp;(B)类型核酸;(C)链性单链;(D)(A)长度60bp;(B)类型核酸;(C)链性单链;(D)(A)长度38bP;(B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形分子类型寡核苷酸序列描述--(A)长度264bP;(B)类型核酸;(C)链性单链;(D)-(A)长度83个氨基酸;(B)类型氨基酸;(C)拓扑结构线形分子类型多肽序列描述HGQ冊SYGLR和GGGGSP齦GCiAFDECC肪LRIVDEQCRCELLAEIAREEQRQARGQ恥RQ啦QRARDLPSfcCGIRP敏CDF
权利要求
,其特征在于,该融合蛋白包括luffinS2
氨基酸片断、人促性腺激素释放激素(GnRH或LHRH)氨基酸片断以及位于两者之间的中间连接肽序列。
,其特征在于,所述的luffinS2氨基酸片断包括luffinS2的全部氨基酸残基。
,其特征在于,所述的中间连接序列由3—6个甘氨酸或丝氨酸组成。
,其特征在于,所述的luffinS2氨基酸片断包括luffinS2的全部氨基酸序列,所述的中间连接序列由3—6个甘氨酸或丝氨酸组成。
,其特征在于,所述的人促性腺激素释放激素氨基酸片断为I型人促性腺激素释放激素的10个氨基酸残基。
,其特征在于,所述的人促性腺激素释放激素氨基酸片断为N端第一个氨基酸由谷氨酰***取代焦谷氨酸的氨基酸片断。
,其特征在于,所述的中间连接肽序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
,其特征在于,所述的luffinS2氨基酸片断包括luffinS2的全部氨基酸残基,所述的人促性腺激素释放激素氨基酸片断为I型人促性腺激素释放激素的N端第一个氨基酸由谷氨酰***取代焦谷氨酸的10个氨基酸残基,所述的中间连接序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
。
,包括以下歩骤a)利用重叠PCR法扩增含luffinS2、人促性腺激素释放激素片断及中间连接肽的片断,所用引物含luffinS2、人促性腺激素释放激素、中间连接肽序列和酶切位点;b)将扩增的片断酶切后回收目的片断,然后连接转入表达质粒;c)将上述得到的质粒转入大肠杆菌,在适宜的培养条件下表达;d)离心回收菌体,超声裂解后经洗涤得到粗制包涵体;e)依次经透析、亲和层析、试剂盒切除His标签并纯化后得到高纯度的融合蛋白.
,用于制备实体瘤治疗药物。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤的重组免疫***及其制备方法和应用。本发明构建了一种靶向***融合蛋白,其含有luffinS2的氨基酸片断、人促性腺激素释放激素以及中间的连接肽。该融合蛋白的制备方法包括1)构建含有目的基因的质粒;2)将质粒转入大肠杆菌表达;3)离心收集菌体,超声裂解经洗涤得到粗制包涵体;4)透析、亲和层析、切除His标签并清除Xa因子。本发明靶向***融合蛋白细胞毒强,应用剂量少,生产成本低;对生长初期肿瘤和一定发展程度的肿瘤均有抑制效果;适用于乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌等实体瘤的治疗。