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专利名称:破伤风***重组抗原制备方法及其应用的制作方法
技术领域:
本发明属于基因工程技术领域,具体地说涉及含破伤风***抗原基因的重组载体,用该载体转化的宿主以及利用转化体生产破伤风***抗原,以及该抗原在破伤风疫苗和结合疫苗蛋白载体中的应用。
背景技术:
破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridiumtetani)的感染引起的,在厌氧条件下细菌产生大量的***-破伤风神经***(简称破伤风***),***侵害中枢神经系统,导致患者全身性肌肉强直性痉挛,严重者最后死于窒息及全身性衰竭。一般估计每年死于破伤风的人数约为100万,其中大约80%为新生儿。由于其症状险恶,发病率和病死率较高,破伤风得到医学界的高度重视。有效控制破伤风的方法是预防接种破伤风类***疫苗。目前大量使用的传统破伤风疫苗是通过甲醛处理破伤风***成为类***后制成的,破伤风梭菌可形成芽孢形式,而且毒性高,生产疫苗有一定危险性,甲醛处理生产类***也容易造成污染;疫苗中含有培养基和菌体杂蛋白,免疫接种后有一定副反应发生,经疫苗生产企业和国家管理部门对培养基成分进行改良,减少了可能引起过敏反应的大分子物质,从而减少接种反应,在采用精制类***后,过敏反应的发生率得到了进一步的控制,但类***接种中还是有一定的副反应发生。另外化学处理后的类***也容易发生毒性逆转。目前破伤风类***疫苗在我国是作为计划免疫接种的,适龄儿童均需接种,因此,疫苗的质量就更尤为重要。因此,传统破伤风疫苗应该得到改进。
破伤风***是由破伤风梭状芽孢杆菌产生并分泌至菌体外的一种蛋白质***,由1315个氨基酸组成,分子量为150700道尔顿。破伤风***在菌体内表达后是一条单一的蛋白质链,在分泌过程中被蛋白酶裂解成有二硫键连接的轻链和重链。根据***在体内的作用,破伤风***分子分为A、B、C三个部分,***的轻链称为***段,重链的N末端一半称为B片段,另一半称为C片段,每个片段的分子量为5万左右。研究结果表明***的B片段可以在人工磷脂膜上形成离子通道(雷殿良,中华微生物学和免疫学进展,1991,11,),将***的活性片段导入细胞内;***段是Zn蛋白酶(.,,242(2),),可裂解神经细胞膜上的传送神经递质的蛋白质-囊泡相关膜蛋白,从而抑制神经递质的释放;C片段是破伤风***与神经细胞表面的神经节苷脂结合的部位(BizziniB.,,28,),具有逆行轴突运输进入中枢神经系统的功能,已被用于研究亚单位疫苗。然而,通过从破伤风***中直接提取和纯化
C片段有很多不利之处破伤风梭菌可形成芽孢形式,而且毒性高,培养、分离过程中存在一定危险性;用破伤风***提取和纯化C片段步骤较复杂,回收率不高。利用分子生物学技术,可使这一问题得到解决。从1986年起,伊索尔(Eisel)和法瓦泽(Fairweather)等就对破伤风***全序列和C片段在大肠杆菌中进行了克隆和表达(EiselU,,5,;Fairweather,.,(19),)。哈泊尔(Halpern)等报道将破伤风***C片段(TTC)基因克隆进pTTQ8载体,%(.,,1990,58,)。马克夫(Makoff)等发现破伤风基因的密码子偏爱性与大肠杆菌的偏爱性大不一样,将TTC基因中的大肠杆菌稀有密码子替换为大肠杆菌的偏爱密码子,并且改进启动子,其表达量可达11~13%(.,,1989,17(24),)。
发明内容
为了克服已有技术的不足,本发明的目的在于提供一种纯度高、副反应发生率低的破伤风抗原的制备方法,以及制备该抗原所用的重组质粒载体及转化体。
目前使用的破伤风疫苗有一定副反应,主要是由于制品纯度不高,在类毒化过程中结合了杂蛋白,增加了副反应的发生率,此外破伤风类***分子本身的分子量较大,抗原性也很强,致敏性亦强。本发明人经过大量的研究探索,研究出一种含有破伤风***抗原蛋白基因的重组质粒载体,由其转化大肠杆菌,克隆并表达破伤风***抗原蛋白基因,获得纯度高的破伤风***抗原蛋白,再由此制备破伤风疫苗,从提高制品纯度和降低类***分子量二个方面来到达改进传统破伤风疫苗的目的。
本发明提供一种重组质粒载体,其含有破伤风***抗原蛋白的基因,是由破伤风***抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)连接,构建成的重组表达质粒载体。所述破伤风***抗原蛋白的基因可以是破伤风***分子的C片段部分(简称TTC)的基因(简称ttc),其构建成的重组表达质粒可表示为pET-22b(+)/ttc。
所述的连接可以采用本领域常规或已知的方法进行,例如所述的连接可以是将利用内切酶酶切处理含有在破伤风***抗原蛋白基因两侧带有限制性内切酶识别位点的克隆质粒得到的破伤风***抗原蛋白的基因,与经相同酶切处理的表达载体pET-22b(+)连接,构建重组表达质粒。所述的内切酶可以是本领域通常使用的内切酶,例如BamHI、HindIII。所述克隆质粒可以是将所述破伤风***抗原蛋白基因与pGEM-TEasy载体连接而成的。所述的连接可以是将含所述破伤风***抗原蛋白基因的PCR产物与pGEM-TEasy载体连接构建成。所述破伤风***抗原蛋白基因的
PCR产物可以用含破伤风***抗原蛋白基因的破伤风梭状芽胞杆菌株培养裂解物作为扩增模板,通过PCR法进行扩增而得。所述破伤风***抗原蛋白基因可以是破伤风***分子的C片段部分的基因,其所述克隆质粒可以表示为pGEM-T/ttc。
本发明提供一种转化体,其由本发明提供的由破伤风***抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)构建的重组质粒载体转化大肠杆菌而得。所述的转化可以按照本领域的常规或已知的方法进行。所述破伤风***抗原蛋白基因可以是破伤风***分子的C片段部分的基因。
本发明提供一种制备破伤风抗原蛋白的方法,包括用本发明提供的由破伤风***抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)构建的重组质粒载体转化大肠杆菌,克隆并表达破伤风***抗原蛋白基因,获得破伤风***抗原蛋白。所述破伤风***抗原蛋白基因可以是破伤风***分子的C片段部分的基因。所述的构建重组载体、转化大肠杆菌、克隆、表达破伤风***抗原蛋白的方法可以按照本领域的常规或已知方法进行。
本发明提供的破伤风抗原蛋白也可以由以下方法制备培养破伤风梭状芽胞杆菌株,例如CMCC64008,取培养裂解物作为扩增模板。设计两端带有BamHI和HindIII酶切位点(斜体)的引物。通过PCR法进行扩增。纯化PCR产物。将纯化的含破伤风***抗原蛋白基因
(例如破伤风***分子的C片段基因)的PCR产物与pGEM-TEasy载体连接,构建重组克隆质粒(例如pGEM-T/ttc)。该重组克隆质粒转化大肠杆菌感受态细胞,提取质粒,经酶切或PCR鉴定得到阳性克隆。克隆质粒(如pGEM-T/ttc)上目的基因两侧带有限制性内切酶BamHI、HindIII识别位点,将其用这两种酶酶切处理得到目的基因,与经相同酶切处理的表达载体pET-22b(+)连接,构建重组表达质粒(如pET-22b(+)/ttc),转化大肠杆菌的感受态细胞,提取质粒,经酶切鉴定得到阳性克隆。表达目的基因片段,获得重组蛋白破伤风***抗原。
本发明可以用常规的纯化方法纯化破伤风***抗原;可以用分子筛、离子交换层析的方法和/或金属离子螯合亲和层析的方法及其他常规或已知的方法。
本发明提供一种破伤风疫苗,其含有按照本发明的方法制备的破伤风***抗原蛋白与佐剂。所述佐剂是可用于制备破伤风疫苗的常规或已知的佐剂。本发明的破伤风疫苗可由按照本发明的方法制备的破伤风***抗原蛋白和常规或已知的佐剂,按照常规或已知的方法制备。采用本法研制的疫苗纯度高、质量可控、生产过程中无***操作、无***逆转现象,分子量小,过敏性低,安全性高,是该类疫苗的新型疫苗,不仅如此,该产品还可用于结合疫苗载体蛋白,由于其明确的成分大大优于现有的类***载体。
本发明提供一种结合疫苗,其含有按照本发明的方法制备的破伤风***抗原蛋白作为破伤风抗原蛋白载体。本发明的结合疫苗可由按照本发明的方法制备的破伤风***抗原蛋白作为载体,按照常规或已知的方法制备。
本发明提供一种结合疫苗的蛋白载体,其含有按照本发明的方法制备的破伤风***抗原蛋白。蛋白载体可增强目的蛋白的免疫原性,有效诱导目的蛋白产生保护性反应。破伤风类***是一种常用的蛋白载体,例如,多糖抗原属T细胞非依赖性抗原,如脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎球菌、b型嗜血流感杆菌(Hib)以及伤寒杆菌等的荚膜多糖疫苗均不能诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答,对婴幼儿免疫效果不佳。为解决这一问题,将上述各种多糖与破伤风类***结合,制成结合疫苗,可大大增强多糖疫苗的免疫效果。本发明提供的蛋白载体与破伤风类***一样,可增强目的蛋白的免疫原性,有效诱导目的蛋白产生保护性反应,而且分子量小、安全性高、纯度高、质量可控、生产过程中无***操作、无***逆转现象。
本发明提供一种破伤风疫苗的制备方法,其包括以下步骤用由破伤风***抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)构建的重组质粒载体转化大肠杆菌,克隆并表达破伤风***抗原蛋白,获得破伤风***抗原蛋白。
所述破伤风***抗原蛋白基因可以是破伤风***分子的C片段部分的基因。所得表达蛋白纯化后与常规或已知的佐剂配制成本发明的破伤风疫苗。
本发明的表达系统对表达破伤风***抗原蛋白是高效的。
本发明利用大肠杆菌表达外源基因,表达效率高,操作简单,成本低。外源基因在大肠杆菌中的高效表达,转录和翻译是两个关键因素。外源基因的转录效率是由启动子的强度决定的,启动子是聚合酶的识别序列,是转录的起始信号,不仅决定转录的起始位点,还决定转录的起始频率。翻译是影响外源基因表达的另一个关键因素,目的基因密码子的偏爱性与大肠杆菌的偏爱性越相似,表达水平越高。
本发明采用的是T7噬菌体表达系统,其表达效率高。这一系统有两个必需组分第一是T7噬菌体基因1的产物-T7噬菌体RNA聚合酶,它可由感染性的λ噬菌体载体提供,也可由已插入大肠杆菌染色体的基因所产生。为此,采用的宿主菌是溶源菌BL21(DE3),其T7噬菌体基因1受控于IPTG诱导的LacUV5启动子,未诱导时处于低水平转录状态。T7噬菌体RNA聚合酶的特点是只识别大肠杆菌染色体DNA中不存在的T7噬菌体启动子;而且是持续合成酶,可沿环状质粒连续转录数次,能转录大肠杆菌RNA聚合酶不能有效转录的基因,这样可以提高质粒上外源基因的转录效率。第二是含有T7噬菌体启动子的表达载体-pET系列载体,这些载体中,外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控。本发明采用的是
pET-22b(+),它的启动子是T7lac,带有氨苄青霉素抗性基因,多克隆位点,T7噬菌体转录终止子,可确保外源基因的有效克隆、转录和表达。pET-22b(+)载体的多克隆位点上游带有信号肽基因,可使外源蛋白分泌表达至细菌外周质。而且,表达产物的羧基端可携带一个串联的六个组氨酸组成的特异亲和结构一6×HisTag,此结构几乎没有免疫原性,简化了重组融合蛋白的纯化。总之,T7噬菌体表达系统是对T7RNA聚合酶水平和目的基因的转录实行多层次的调控,以使目的蛋白得到高效表达。
本发明中,将ttc目的片段基因克隆到pET-22b(+)表达载体上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,结果是pET-22b(+)/ttc的表达量占菌体总蛋白的15%,其主要以包涵体的形式存在于菌体中。T7噬菌体表达系统是一高效表达系统,与已有技术相比,pET-22b(+)/ttc的表达量较高。目的蛋白TTC的氨基酸残基数目是451个,序列过长容易影响表达量;破伤风***基因的密码子偏爱性与大肠杆菌的密码子偏爱性大不一样,这可能降低核苷酸密码子翻译成氨基酸的效率,从而影响蛋白的表达量。已有技术中Halpern将TTC基因克隆进pTTQ8载体,%,Makoff等人将TTC基因中的大肠杆菌稀有密码子替换为大肠杆菌的偏爱密码子,并改进启动子,其表达量为11-13%。本发明采用的是未替换密码子的原始基因序列,表达量为15%,说明本发明的表达系统对表达破伤风***抗原蛋白是高效的。
本发明制备的重组抗原蛋白可以包涵体形式存在。包涵体的形成有一定的优点,能有效防止细胞内蛋白酶对目的蛋白的水解作用,使目的蛋白大量聚集,更加稳定。经尿素、盐酸胍等变性剂处理后变为可溶状态,较易纯化,通过透析可除去变性剂。其对不溶性蛋白的分离非常有利。本发明的载体转化大肠杆菌的表达产物用离子交换层析、金属螯合亲和层析的纯化方法,%的表达产物,纯化回收率达45%。
本发明制备的破伤风***抗原具有抗原活性。经免疫攻击实验测定本发明制备的破伤风抗原具有免疫活性,可以诱导动物产生抗体,经加强免疫,1μg的本发明制备破伤风抗原即能产生足够的抗体保护动物免受破伤风***的攻击,说明本发明制备的破伤风抗原具有较好的免疫原性,与天然的破伤风***抗原蛋白具有相同的功能。
本发明的重组载体和转化体既有高效表达破伤风***抗原蛋白、易于繁殖、安全等优点。本发明制备的重组抗原蛋白具有纯度高、免疫原性好、安全性好的优点。本发明提供的方法具有简单、高效的优点。
本发明提供的疫苗纯度高、质量可控、生产过程中无***操作、无***逆转现象,分子量小,过敏性低,安全性高,是该类疫苗的新型疫苗。