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专利名称:磁性细胞及其使用方法
技术领域:
本发明涉及在医疗、尤其是再生医疗中有效使用的磁性细胞及其使用方法。
背景技术:
一般而言,在给药后药物分布于全身,因此,对于以抗癌药为首的:.副作用较强的药物,希望其以高浓度存在于作用部位,而不分布于其它部位。为了使药物集中于局部,已尝试了各种方法,其中之一为使用磁性粒子,通过外部的磁力使药物集中于局部的方法。例如,将磁性体与药物一同包含在脂质体内给药,并通过磁力向局部诱导,从而能够提高
药物的局部浓度。(例如参照日本口腔外科学会志1997年2月号p55-、61)。
另外,已知有将由磁铁矿等铁磁体和高分子形成的磁珠表面以抗体修饰、利用抗原抗体反应进行细胞分离形成的技术,该技术用于HLA的定型、造血干细胞的选择等(例如参照Biomaterial2003年2月号p113.-119)。
发明内容
但是还没有在可应用于再生医疗等之中的间叶细胞或软骨细胞等细胞中结合了磁性粒子的实例。因此在结合了磁性粒子的细胞给药后能否通过外部的磁力而在局部滞留、或者细胞能否发挥其本来的作用等方
'—面还存在有较多需要解决的未知问题。
本发明人等经过深入研究,结果着眼于细胞表面的性能而完成了本发明。即,本发明的第一种方案为提供一种在细胞表面具有磁性粒子的'磁性细胞。通过该细胞的构成,能够利用磁性粒子的磁性将细胞移动至理想的部位。
本发明的磁性细胞的优选方案中,前述表面与前述磁性粒子通过连
接体(linker)结合,或者前述表面通过前述磁性粒子具有的特定氨基酸序列粘合。作为前述特定的氨基S吏序列,例如可以举出精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的四个氨基酸构成的肽(RGDS)、或者甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的五个氨基酸构成的肽(GRGDS)。
本发明的;兹性细胞的优选方案中前述表面和前述连4妄体通过抗原抗体反应进行结合。
本发明的磁性细胞的优选方案中,前述连接体和前述》兹性粒子通过化学键结合。
本发明的磁性细胞的优选方案中,前述磁性粒子中至少包含磁性体。
本发明的磁性细胞的优选方案中,前述磁性粒子中还包含药物。
本发明的磁性细胞的优选方案中,前述细胞选自软骨培养细胞、间
叶细胞、淋巴细胞及表达整联蛋白的细胞。
本发明的第二种方案为提供一种培养磁性细胞的方法,所述方法包括制备前述磁性细胞的步骤和培养前述磁性细胞的步骤。
另外,本发明的第三种方案为提供一种滞留磁性细胞的方法,所述方法包括下述步骤,即,使前述磁性细胞向病灶部位移动并保留在该部位的步骤,和通过磁场使前述磁性细胞长时间滞留在前述病灶部位的步骤。
本发明的滞留方法的优选方案中,前述滞留步骤通过在体外对病灶部位施加前述磁场或将磁石埋入体内而得以实施。
另外,本发明的第四种方案为提供一种控制磁性细胞活动的方法,所述方法包括以下步骤,即,将前述磁性细胞和含有药物的磁性粒子同时或者分别给予病灶部位的步骤,和从前述磁性粒子中释放前述药物的步骤。
本发明的控制方法的优选方案中,前述药物选自促骨形成药、癌治疗药、或者痴呆症治疗药。.另外,本发明的第五种方案为提供一种治疗方法,所述方法包括以下步骤,即,将前述磁性细胞和含有药物的磁性粒子同时或者分别给予病灶部位的步骤,和从前述磁性粒子中释放出前述药物的步骤。
本发明的治疗方法的优选方案中,前述药物选自促骨形成药、癌治疗药、或者痴呆症治疗药。,
通过将本发明的磁性细胞导入生物体内,并利用体外的磁场作用,
可以将其长时间保留在病灶部位,因而能够有效发挥该细胞本来具有的功能。另外,通过利用本发明中的磁性细胞,可根据治疗的需要,适用
于软骨形成等再生医疗或抗癌药等的药物释;^文系统。'
图l示出本发明的第一种实施方案中磁性细胞的简图。图2示出本发明的第二种实施方案中磁性细胞的筒图。
图3示出作为再生医疗的软骨修复说明图。
图4示出将本发明的磁性细胞注射到关节内l个月后,约72小时不存在外部磁场的情况(A)以及存在外部磁场的情况(B)观测到的显樣吏镜照片(50倍)。
图5示出在大鼠骨髓间叶干细胞中观测到的、本发明磁性细胞的制备例2(A)及3.(B)中制备的磁性细胞的显《鼓镜照片(4S0倍)。
图6示出用软骨诱导培养基对本发明中通过CD44或RGDS肽制成的磁性细胞(大鼠骨髓间叶干细胞)进行21天沉淀培养后,利用RT-PCT法研究II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖(来自软骨)的mRNA(基因)表达的结果。
图7为利用大鼠的神经干细胞说明本发明磁性细胞的形成状态的照片,(A)为400倍的照片,(B)为1600倍的照片。
具体实施例方式
下述实施方案是用于说明本发明的示例,本发明不仅限于所述实施方案。只要不脱离本发明的要点,也可以通过各种方案实施本发明。(第一种实施方案)本发明的磁性细胞是基于对存在于细胞表面的粘合成分的利用而得到的。图1为本发明的第一种实施方案中磁性细胞10的简图。该磁
性细胞10含有it性粒子60,所述磁性粒子60通过连接体50与糖蛋白质40结合,所述糖蛋白质40表达在含有核30的细胞20的表面。本发明中利用的糖蛋白质40并不限定于下述物质,但优选CD44或HLA。■
作为本发明的磁性粒子60,例如可以举出含有磁性体70的脂质体。所述脂质体中可以进一步含有能够控制细胞功能的药物80,另外,磁性体及药物也可以使用其它类型的包封材料进行包封。
此处,脂质体为具有水性内部的球形脂质双层。形成脂质体时,存在于水性溶液中的分子进入水性内部。脂质体的内容物被保护于外部的微环境之外,并且由于脂质体与细胞膜融合因而该内容物可被有效输送至细胞质内。
本发明中使用的脂质体只要是普通的公知脂质体即可,尤其可以举出能够用于口服给药或者注射的脂质体。可以适用上述脂质体,也可以利用公知的材料重新设计、形成脂质体。具体而言,优选使用含有磷脂、甘油醚磷脂(etherglycerophosphatide)、.(神经)鞘磷脂、甘油糖脂、神经鞘糖脂作为脂质体膜的主要构成成分,并含有甾醇类或生育酚类等作
为使脂质体膜稳定化的脂质成分的脂质体等。
作为上述磷脂,可以使用天然磷脂、合成磷脂等普通的公知磷脂。优选使用下述磷脂,例如(1)磷脂酰胆碱、(2)磷脂酰乙醇胺、(3)磷脂酰甘油、(4)磷脂酰丝氨酸、(5)磷脂酸、以及(6)磷脂酰肌醇等。
上述(1)的磷脂酰胆碱可以举出,例如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、源自大豆的磷脂酰胆碱、源自大豆的氢化磷脂酰胆碱等天然磷脂酰胆碱类;含有碳原子数为7~22的饱和或者不饱和羧酸作为构成成分的磷脂酰胆碱等合成磷脂酰胆碱类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱等。作为上述脂肪酸残基可以举出辛酰基(octanoyl)、壬酰
基(nonanoyl)、癸酰基(decanoyl)、十一烷酰基(undecanoyl)、十二烷酰基(rauroyl)、肉豆蔻酰基(myristovl)、棕榈酰基(palmitoyl)、油基(oleyl)、硬脂基(stearyl)、棕榈油酰基(palmitoleyl)、亚油酰基(linoleyl)、亚麻酰基(linolenyl)、花生四烯酰(arachidonyl)等基团。另外,结合在甘油的1-位、2-位的脂肪酸残基部分可以相同也可以不同。
前述(2)的磷脂酰乙醇胺可以举出例如,源自大豆的磷脂酰乙醇
胺、源自大豆的氩化磷脂酰乙醇胺等天然磷脂酰乙醇胺类;含有碳原子数为722的饱和或者不饱和羧酸的磷脂酰乙醇胺等合成磷脂酰乙醇胺类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等。作为脂肪酸残基,可以举出与前述(l)同才羊的基团。
前述(3)的磷脂酰甘油可以举出例如,含有碳原子数为7~22的
饱和或者不饱和羧酸的磷脂酰甘油等合成磷脂酰甘油类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘
油等。作为构成脂肪酸残基,可以举出与前述(l)同样的基团。
前述(4)的磷脂酰丝氨酸可以举出例如,源自大豆的磷脂酰丝氨酸、源自大豆的氢化磷脂酰丝氨酸等天然磷脂酰丝氨酸类;含有碳原子数为7~22的饱和或者不饱和羧酸的磷脂酰丝氨酸等合成磷脂酰丝氨酸类。作为具体例可以举出二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸等。作为构成脂肪酸残基,可以举出与前述(1)同样的基团。
前述(5)的磷脂酸可以举出例如,含有碳原子数为7~22的饱和或者不々包和羧酸的磷脂酸等合成磷脂酸类。作为具体例可以举出二肉豆
蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酸等。作为构成脂肪酸残基,可以举出与前述(l)同样的基团。前述(6)的磷脂酰肌醇可以举出例如,源自大豆的磷脂酰肌醇、源自大豆的氩化磷脂酰肌醇等天然类磷脂酰肌醇;也可以使用合成类磷脂酰肌醇。作为构成脂肪酸残基,可以举出与前述(1)同样的基团。另外,作为本发明中使用的脂质体膜的构成成分,也可以使用甘油磷脂、(神经)鞘磷脂、甘油糖脂、神经鞘糖脂等。本发明中作为使脂质体膜稳定化的脂质成分,可以使用甾醇类或生育酚类。作为前述甾醇类,只要是普通公知的甾醇类即可,可以举出例如,胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇等,从购入性方面考虑,优选使用胆甾醇。作为前述生育酚类,只要是普通公知的生育酚类即可,从购入性方面考虑,优选使用市售的CC-生育酚。
作为本发明中使用的包封材料,可以使用离子交换树脂、结晶性陶瓷、生物体可适性玻璃、胶乳,也可以与'各种表面活性剂一同制成微球进行使用。而且,也可以使用毫微球、及其它脂质、聚合物或者蛋白质
材料作为前述包封材料。包封材料的直径优选为数十~数百nm,没有
特别的限制。另外,所述药物的包封材料至少含有磁性体,可以包含药物,也可以不包含药物,但是从细胞控制方面考虑,优选包含药物。
另外,本发明的药物包封材料也可设置用于控制药物释放的药物释放控制成分,作为控制药物释放速度的成分,可以举出高分子、温度敏
感性分子、超声波及/或磁敏感性物质。具体可以举出特开平5-228358记载的具有浊点的高分子化合物(聚丙烯酸类聚合物),特开平11-92360记载的超声波敏感性物质(外啉衍生物、.卩占吨衍生物)等。
作为本发明中利用的磁性体,只要是具有磁性的物质即可,无任何限制,常磁性、超常磁性、强磁性均可,强磁性中除了亚铁磁性,也包括铁磁性。作为磁性体的具体例,除了磁铁矿(Fe304)、磁赤铁矿之外,还可以举出铁、钴、镍等强磁性元素的化合物粒子。所述强磁性化合物中,磁铁矿、磁赤铁矿未表现出对生物体的毒性,并且稳定,因此被优选4吏用。特别优选磁铁矿。
前述磁性体不仅包括前述强磁性化合物单独存在的情况,也可以包括用纤维素、淀粉、糊精、琼脂、甲基丙烯酸酯或苯乙烯等进行包埋或由磁性细菌生物合成、经磷脂被覆磁铁矿得到的磁性粒子。
下面说明本发明中使前述细胞的表面具有磁性粒子的方法。作为该方法,可以举出细胞表面的反应性官能团和磁性粒子的反应性官能团通
过共价4建结合的方法、或通过连接体使其结合的方法等。作为本发明中使用的连接体,可以举出两个末端具有羧基或氨基等反应性官能团的化
合物(以下,简称为"双官能性间隔体(bifimctionalspacer)")或者抗体。作为细胞与磁性粒子通过连接体结合的方法,可以举出下述优选例,例如,使粉碎磁性细菌得到的被覆有磷脂膜的磁性粒子通过双官能性间隔体与细胞表面的反应性官能团结合的方法;或者通过抗原抗体反应使细胞表面的HLA或CD44等粘合分子结合在下述结构上的方法等,前述结构为使表面经羧基修饰的磁性粒子和用作连接体的抗体的氨基键合成酰胺《定而形成的结构。
本发明的磁性细胞可以为下述任一形式,即,磁性粒子含有在细胞内部,^磁性粒子结合在细胞表面,或者磁性粒子通过连接体结合在细胞表面。作为使磁性粒子含有在细胞内部的方法,可以通过对磁性粒子实施例如特开平6-133784记载的利用粒子枪的方法而实现。.
本发明的第一种实施方案中,作为前述磁性粒子60中含有的药物80,可以举出以细胞因子(cytokin)等负责细胞信息传递体系的物质为代表的生理活性物质等,但是并不限定于此。作为细胞因子的具体例,可以举出干扰素类(IFN-a、IFN-(3、IFN-y等)、白细胞介素类(IL-1~18等)、淋巴毒素类、肿瘤坏死因子(TNF-cx等)、粒细胞巨噬细胞集落