促进β细胞复制的化合物及其使用方法.docx

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专利名称:促进β细胞复制的化合物及其使用方法
技术领域:
本发明涉及促进β细胞复制和/或生长的组合物与方法。
背景技术:
存在以下两种形式的糖尿病(I)胰岛素依赖型糖尿病或I型糖尿病(又名,幼年型糖尿病、脆弱性糖尿病,胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))以及(2)非胰岛素依赖型糖尿病或2型糖尿病(又名NIDDM)。I型糖尿病最经常在青少年身上发病,但可在成年人中出现。2型糖尿病最经常在中年或老年人身上发病,但也可在年轻人中出现。糖尿病是一种由多种诱发因素引发的疾病,其特征在于禁食状态下或口服葡萄糖耐量试验期间服用葡萄糖后血浆葡萄糖水平上升(高血糖症)。在I型和2型糖尿病中都发生β细胞团块(β-cellmass)的减少。I型糖尿病是一种自身免疫疾病状况,其特征在于由完全没有胰岛素(S卩,胰腺β细胞功能和团块的丧失)而引起的高血糖水平。当人的免疫系统对在胰腺中的产胰岛素β细胞进行攻击并将其破坏时,发生I型糖尿病。目前普遍相信,细胞因子的白细胞介素12(IL-12)家族以及信号转导与转录活化因子家族中的成员、如STAT-4(被认为是参与免疫应答的T-细胞分化调节剂)的下游活化,在导致自身免疫性的β细胞毁坏过程中起主要作用。胰腺随后几乎或完全不产生胰岛素。所经历的最常见的
I型糖尿病症状中包括过度口渴(烦渴)、频繁排尿(尿频)、极度饥饿(多食)、极度疲劳以及体重下降。这些症状是由高血糖症以及身体脂肪分解造成的。被诊断患有I型糖尿病的人通常表现出高于300mg的血糖水平,并且在尿中出现酮。β细胞团块的恢复与胰岛素生产可以完全逆转糖尿病的状态。有证据表明,患有长期I型糖尿病的人持续有β细胞生成,但是被持续的自身免疫毁坏作用令人不希望地加以破坏。因此,使β细胞的复制得以增加的组合物与方法可以提供使正常的β细胞团块水平得以恢复、并逆转或治愈I型糖尿病的有效途径。LADA是I型糖尿病最新认识到的一种亚型,被认为占到所有糖尿病病例的高达10%-20%。。LADA经常在起初被诊断患有2型糖尿病的人之中出现。尽管它具有类似于成年人I型糖尿病发病的特征,但β细胞的毁坏在其进程中被认为没有那么严重。2型糖尿病是由胰岛素抵抗与胰岛素分泌受损结合产生的,但是患有2型糖尿病的很多人最终都显示出胰腺β细胞团块与功能的明显减少,转而使得患有2型糖尿病的人胰岛素“相对”不足,这是因为胰腺β细胞仍然产生部分胰岛素,但是这些胰岛素或者太少,或者不能合适地工作以便使葡萄糖充分进入细胞中产生能量。最近的尸检研究中获得明显的证据,显示了在患有2型糖尿病的人体内身体中持续的β细胞死亡(细胞凋亡)。所以,提供更多
β细胞的治疗途径可以为逆转或治愈2型糖尿病提供明显的治疗作用。不加以控制的2型糖尿病引起血液中的葡萄糖过量,导致高血糖症。患有2型糖尿病的人会感觉到疲劳、口渴加重、尿频、皮肤干燥发痒、视力模糊、伤口愈合慢、多于正常水平的感染以及足部的麻木刺痛感。如不进行治疗,患有2型糖尿病的人会脱水,且血液总量会发展到危险的低位。如果2型糖尿病的病人在很长时间内不加以控制,会产生更多严重的症状,包括重度高血糖(血糖超过600mg)、昏睡、混乱、颤抖、以及最终的“高渗透压高血糖非酮性昏迷”。持续或不加以控制的高血糖症还与婴儿发病率与死亡率(prematuremorbidityandmortality)的增长相关。因此,对葡萄糖动态平衡、脂质代谢作用、肥胖和高血压的治疗控制在临床管理和糖尿病治疗方面是非常重要的。治疗糖尿病的目标是通过改善高血糖状态来避免出现上述所提及的慢性并发症(缓慢疾病进程)的出现,或是使其得以逆转/治愈。治疗糖尿病的传统方法包括对于I型糖尿病的情况,给予流食与胰岛素;对于2型糖尿病的情况,给予各种降血糖药。诸如胰岛素制剂、胰岛素促分泌剂、胰岛素增敏剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂等降血糖药被广泛地用作临床治疗的方法。其实例包括阿卡波糖(PrecoseJ)、glimeprimide(AmarylJ)、二甲双胍(GlucophageV)、那格列奈(StarlixV)、卩比格列酮(ActosV)、瑞格列奈
(PrandinJ)、罗格列酮(AvandiaV)、磺酰脲类、奥利司他(XenicalV)和艾塞那肽(Byetta)等。然而,很多已知的降血糖药都表现出了不合人意的副作用,并且在某些情况下是有毒的。举例而言,对于糖尿病患者患有严重的胰腺胰岛素分泌降低的情况,胰岛素促分泌剂与胰岛素增敏剂的有效性降低。类似地,对于糖尿病患者的胰岛素抵抗明显很高时,胰岛素制剂与胰岛素促分泌剂的有效性降低。原则上,可以采用对含有分泌或产生胰岛素的细胞组织(即胰岛)进行成功移植来治疗糖尿病。对产胰岛素细胞进行移植的方法已经被尝试作为一种用于逆转或治愈I型糖尿病的方法,但是存在与外科手术有关和与有毒的免疫抑制型药物(需要服用该药物来预防或减轻异体移植排异以及自身免疫的复发)有关的显著风险。此外,如今在美国有超过一百万名患有I型糖尿病的人,但是由尸体的胰腺组织供应胰岛却是有限的。例如,每年仅能获得6000个器官,需要2个或3个器官才能提供足够的胰岛来逆转一个人的I型糖尿病。所以,急迫地需要提供具有功能(胰岛素生成)的β细胞的新来源。对于可诱导β细胞增殖的化合物的高通量筛选分析,本领域中只记载了一个实例。这一筛选方法利用了生长阻滞、可逆性永生化的小鼠β细胞。这一方法的主要缺点是经过这种筛选方法鉴定出的化合物对原代β细胞可能不具有相同的效果,也就是说,所鉴定出的化合物只是专门用于在生长阻滞、可逆性永生化的小鼠
β细胞中诱导增殖。所以,需要对可诱导原代β细胞(例如,没有发生转化的β细胞)增殖的化合物进行筛选的方法。
发明内容
本发明一方面提供了使胰腺细胞群中的β细胞复制增加的方法,所述方法包括用腺苷激酶(ADK)的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制剂或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化剂与胰腺细胞群进行接触。本发明另一方面提供了对用于增加β细胞复制的候选化合物进行筛选的方法,所述方法包括如下步骤Ca)将测试化合物与胰腺细胞群进行接触;(b)选择如下化合物(i)使培养物中的细胞总数增加;(ii)相比于未处理的对照,使培养物中表达至少一种β细胞标记的细胞总数增加;(iii)相比于未经处理的对照,使表达至少一种β细胞标记的细胞相对于培养物中细胞总数的比例增加;(iv)相比于未经处理的对照,使表达至少一种细胞复制标记的细胞数增加;或者(V)相比于未经处理的对照,使表达至少一种细胞复制标记的细胞比例增加;并且其中,胰腺细胞是原代胰腺细胞。
图I描述了示出由AlO和B8引起的、PH3相对于TOXl增加的百分比的柱状图。
图2a和图2b描述了示出化合物AlO(5-IT)的浓度对β细胞增殖(图2a)和小鼠皮肤成纤维细胞增殖(图2b)的影响的曲线图。对
(EC50=)。图4描述了示出在处理4天后,化合物AlO和Β8对Ki-67的诱导倍数的折线图。在第O天加入化合物,并在第2天更换介质。图5描述了示出介质的血清浓度对Ki-67诱导作用(由ΙμΜAlO在β细胞中引起)的影响的柱状图。图6描述了示出葡萄糖对β细胞中的Ki-67诱导作用和Η)Χ+表达(由AlO引起)没有影响的曲线图。图7描述了示出腺苷不以浓度依赖的方式引起对大鼠胰岛中rox+和Ki-67诱导作用的曲线图。图8a和图8b描述了示出腺苷受体拮抗剂对AlO诱导的Ki-67增加作用的影响的柱状图。图8a:以2μM、IμM、、(无拮抗剂)浓度的拮抗剂进行试验。图8b:。图9描述了示出腺苷激酶抑制剂AlO和腺苷单磷酸活化激酶活化剂AICAR对β细胞复制的影响的柱状图。图10描述了示出AMPK-抑制作用对AlO诱导的β细胞复制的影响的柱状图。图Ila和图Ilb描述了某些示例性腺苷激酶抑制剂的结构,分别为基于核苷的腺苷激酶抑制剂(图Ila)和基于非核苷的腺苷激酶抑制剂(图lib)。图12为示出体内β细胞复制的增加作用的柱状图。图13a-图13d显示出腺苷激酶抑制剂(ADK-Is)诱导了大鼠、小鼠和猪的β细胞的增殖。图13a显示出促进β细胞复制的某些示例性
ADK-Is的化学结构与名称。图13b显示出剂量反应曲线,示出了在对ABT-702处理的应答中,鼠β细胞增殖(上图)和猪β细胞增殖(下图)之间的关系。图13c显示出大鼠胰岛培养物的剂量反应曲线,所述曲线示出了用化合物5-IT(左图,EC50=)和ABT-702(右图,EC50=)进行处理与β细胞增殖之间的关系。图13d显示出用DMSO或5-ΙΤ(2μΜ)处理96h和144h后对β细胞数的定量。误差棒表示标准差,相对于用辅料进行处理的情况*Ρ〈。图14a和图14b显示出β细胞表达出核腺苷激酶(ADK),其作为增殖作用的细胞自主负性调节剂。图14a为示出siRNA介导的ADK下调作用(knockdown)的Western印迹,该下调作用使用来自经稳定转导的细胞的H4IIE(大鼠肝细胞系)裂解物进行评价,所述转导使用阴性对照siRNA(I道和3道)或ADK导向的siRNA(2道和4道)。用Y-微管蛋白将负载标准化。图14b为示出在感染含有对照siRNA序列(左图)或ADK导向的siRNA序列(右图)的病毒后,对β细胞复制进行定量的柱状图。在病毒编码的GFP表达的基础上,分别对同一孔中的未感染细胞和感染细胞的复制速率进行分析。误差棒表示SEM(η=8个独立的孔);*Ρ〈。图15a和图15b显示出由ADK-Is诱导的β细胞复制对葡萄糖和胰高血糖素样肽-I受体(GLP-IR)激动剂的加合作用。图15a为示出在多种葡萄糖浓度加上DMSO或5-ΙΤ(211|0存在的情况下,对培养
2411、4811或9611后的β细胞复制速率进行定量的柱状图。将各时间点的值归一化至5mM葡萄糖加上DMSO处理条件。各处理条件的标准差小于10%,误差棒未示出。在相同葡萄糖浓度和时间点下,当将经5-IT处理的孔与经DMSO处理的孔相比时,*P具体实施方式
本发明一方面提供了使胰腺细胞群中的β细胞复制得以增加的方法,所述方法包括用腺苷激酶(ADK)的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制剂或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化剂与胰腺细胞群或制备品进行接触。本文所使用的“使β细胞复制得以增加”意味着β细胞以更快的速率和/或更高的频率进行复制。在本发明的这一方面或其它方面的一些实施方式中,相对于未经处理的对照,β细胞复制增加了至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、、、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。可通过测定与本文所述的化合物接触时发生复制的β细胞数目(相对于β细胞不与化合物接触的对照),从而确定β细胞复制的增加百分比或增加倍数。复制的增加也可基于发生复制的细胞同分别处理的细胞和未经处理的对照中的细胞总数的比值。在一些实施方式中,经处理和未经处理的对照中的细胞总数被用来确定复制频率。在某些实施方式中,“使β细胞复制得以增加”也包括由于β细胞祖细胞分化成β细胞而引起的β细胞数的增加。在可选的实施方式中,
“使β细胞复制得以增加”不包括由于β细胞祖细胞分化成β细胞而引起的β细胞数的增加。本文所使用的术语“β细胞”包括原代胰腺β细胞;由去分化细胞衍生而来的胰腺β样细胞,所述去分化细胞例如诱导的多能干细胞(iPSCs);或者直接由内胚层起源的细胞(例如,肝细胞或外分泌的胰腺细胞)重编程而来的胰腺β样细胞。在一个实施方式中,β细胞不是永生化细胞系(例如在培养物中无限增殖)。在一个实施方式中,β细胞不是经转化的细胞、例如显示出转化特性(如在软琼脂上生长或不存在接触抑制)的细胞。本文所使用的术语“胰腺β样细胞”是指如下细胞表达出内源性胰腺β细胞所表达的胰岛素量的至少15%、或至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或至少约100%或者高于100%、、或至少约2倍、、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或者高于约5倍。在一个实施方式中,胰腺β样细胞表现出内源性胰腺β细胞的至少一种或至少两种特性,例如但不限于作为对葡萄糖的响应而分泌出胰岛素,和表达β细胞标记物(例如c-肽、Pdx-I和glut-2)。本文中胰腺β样细胞有时是指“重编程β细胞”,本文中该术语可与术语“胰腺β样细胞”互换使用。在一个实施方式中,胰腺
β样细胞不是永生细胞(例如在培养物中无限增殖)。在一个实施方式中,胰腺β样细胞不是经转化的细胞、例如显示出转化特性(如在软琼脂上生长或不存在接触抑制)的细胞。本文所使用的术语“去分化细胞(de-differentiatedcell)”指的是由已分化细胞重编程的细胞。本文所使用的术语“经重编程”或“重编程”是指改变或逆转体细胞分化状态的方法。在重编程前,细胞可部分分化或终末分化。重编程涵盖了将体细胞分化状态完全逆转为多能细胞。分化作用的这种完全逆转产生了经诱导的多能(iPS)细胞。重编程还涵盖了分化状态的部分逆转,例如逆转至多功能状态(multipotentstate)或逆转至既非多能也非多功能的体细胞(丧失了其所来源的已分化细胞的一种或多种特征的细胞),例如由已分化细胞直接重编程至不同的体细胞类型。重编程通常包括改变(例如逆转)至少一些可遗传类型的核酸修饰(例如甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等,上述作用发生在作为受精卵发育为成体的细胞分化期间。本文所述的方法可应用于由重编程(去分化)细胞衍生而来的胰腺β样细胞。例如,通过使用本领域技术人员已知的因子和条件分化成胰腺β样细胞的iPS细胞得到。也可通过对内胚层体细胞/外分泌体细胞直接进行重编程而无需逆转至多能干细胞状态(例如,iPS细胞)来衍生得到胰腺β样细胞,例如在Zhou等,Nature,第455卷,2008年10