文档介绍：该【EFHD2蛋白的缺失对小鼠Sertoli细胞紧密连接蛋白的影响 】是由【芳官】上传分享，文档一共【6】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【EFHD2蛋白的缺失对小鼠Sertoli细胞紧密连接蛋白的影响 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。-1744-安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2022Nov;57(11)
网络出版时间:2022-09-1507:56网络出版地址:.
EFHD2蛋白的缺失对小鼠Sertoli细胞紧密连接蛋白的影响
叶晓林胥国麟】,钱体军2,秦凤S王云涛程煜航彳,赵文珍
摘要目的研究EF-手域蛋白D2(EFHD2)在小鼠睾丸内Sertoli细胞。EFHD2蛋白表达降低后,Occludin蛋白表达也
的定位及表达,及EFHD2蛋白在Sertoli细胞中的缺失对紧减少。结论EFHD2蛋白在睾丸组织中表达量相对较高,
密连接蛋白组分Occludin的影响。方法取成年小鼠心、主要分布于睾丸Sertoli细胞中,与波形蛋白共定位,且能影
肝、脾、肺、肾、脑及睾丸组织提取总RNA和蛋白质,运用响紧密连接蛋白Occludin的正常表达。提示EFHD2能促进
qRT-PCR和Westernblot检测EFHD2在各器官组织中mR-和维持Sertoli细胞的细胞连接结构,为精子发生提供一个稳
NA和蛋白质水平的差异性;运用免疫荧光和免疫组化技术,定的微环境。
检测EFHD2在睾丸组织中的定位和表达。运用siRNA干扰关键词EF-手域蛋白D2;睾丸;Sertoli细胞;Occludin蛋白;
技术降低Sertoli细胞中EFHD2来检测Occludin蛋白的表波形蛋白;精子发生
达。结果qRT-PCR显示EFHD2在睾丸中表达量最高;
Westernblot结果显示在睾丸组织中表达水平较高;间接免
文献标志码A文章编号1000-1492(2022)11-1744-06
疫荧光和免疫组化结果显示该蛋白主要分布在Sertoli细胞
doi:.issnlOOO-
内,与细胞骨架波形蛋白具有共定位,即明确该蛋白表达在
EFHD2属于EF-手域家族成员,
2022-06-06接收
大小的高度保守的蛋白质,由一个低复杂性的带有
基金项目:国家自然科学基金(编号:82160280);云南省科技厅科技
计划项目(编号:202101BA070001-041,202101BA070001-丙氨酸延伸的N-末端区域、一个功能性SH3结合基
108,202001BA070001-084)序、两个功能性EF-手结构域和一个C-末端螺旋结
作者单位:大理大学基础医学院1组织学与胚胎学教研室、2病原与构域组成。研究显示其功能为一种调节因子,能够
媒介生物研究所,大理671000调节肌动蛋白构成细胞骨架,参与成核作用,同时调
3大理大学2018级临床医学专业,大理671000
节细胞的扩散和迁移12],还参与内吞和囊泡运
作者简介:叶晓林,男,硕士研究生;
输27o目前EFHD2在神经系统疾病和肿瘤细胞
赵文珍,女,教授,硕士生导师,责任作者,E-mail:zwz6565
***@,主要是涉及信号传导及细胞
wereusedtotreatSH-SY5Ycellsfor24h,andthenCellCountingKit-8(CCK-8)assaywasusedtoscreenthe
proliferationabilityofSH-SY5Ycells;SH-SY5YcellsweretreatedwithNaFanddifferentconcentrationsof2-BFI
(,,,,|jimol/L)for24h,andtheproliferationabilityofSH-SY5Ycellswasdetectedby
CCK-,themito­
chondrialfunctionwasdetectedbyATPdetectionkitandMito-TrackerRedCMXRoskit,cellapoptosiswasdetec­
tedbyTUNELstaining,andtheexpressionsofBcl-2,Bax,andcleavedcaspase-3proteinweredetectedbyWest­
-SY5YgraduallydecreasedwiththeincreaseofNaFconcentration・
・2-,
thecellsurvivalratewashigher(99・169%),and10mmol/Lwasselectedasthe2-BFIfollow-upexperimental
,themitochondrialmorphologyoftheNaFgroupchanged,ATPlev­
elsandmitochondrialmembranepotential(Ai|/m)decreased,theapoptosisrateincreased,Bcl-2proteincontent
decreased,expressionofBaxandcleavedcaspase-,2-BFIadminis­
trationimprovedmitochondriamorphology,increasedATPlevelsandAijim,reducedcellapoptosisrate,increased
Bcl-2proteincontent,andreducedBax,cleavedcaspase--BFIcanimprove
mitochondrialmorphologyandfunction,reducecellapoptosis,andplayneuroprotectiveroleinfluorosisSH-SY5Y
cells.
Keywordsfluorosis;2-BFI;SH-SY5Y;mitochondriaapoptosis
安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2022Nov;57(11)・1745・
骨架蛋白相关。推测EFHD2能够调节肌动蛋白的表1qRT-PCR涉及引物序列
捆绑影响细胞骨架,参与的细胞内吞和囊泡运输为引物名称引物序列(5'3)—
p-actmF:AGCCATGTACGTAGCCATCC
Sertoli细胞的细胞连接的清除和形成提供协助。该
R:GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA
研究主要探讨EFHD2蛋白的缺失对Sertoli细胞连EFHD2F:CAGGGATGGCTTCATCGACC
接蛋白成分的影响。R:CACCTCCTGGATCATACTCTTGA
GAPDHF:TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT
1材料与方法R:CCTCGTCCCGTAGACAAAATG
11仪器荧光显微镜(BX53,日本奥林巴斯公表2siRNA干扰序列
司),Bio-Rad成像系统(Bio-RadXR,伯乐生命医学引物名称引物序列(5'3)
产品上海有限公司),实时荧光定量PCR仪mEFHD2-731F:GCAGCGGAAAGCGGCCUUUAATT
(SteponePlus,美国应用生物系统公司),伯乐垂直R:UUAAAGGCCGCUUUCCGCUGCTT
mEFHD2474F:GACGAGGAUUUCGACAGCAAATT
电泳转印系统(Bio-RadPowerPac™基础电泳仪电源
R:UUUGCUGUCGAAAUCCUCGUCTT
1645050、小型垂直电泳转印槽,伯乐生命医学产品mEFHD2-308F:GUUCAAGGAGUUCUCCAGGAATT
上海有限公司)。R-UUCCUGGAGAACUCCUUGAACTT
12主要试剂艾博抗(上海)贸易有限公司:An-
ti-EFHD2抗体(ab106667),Anti-Vimentin抗体产物cDNA在实时荧光定量PCR仪上进行定量扩
(ab8978),Anti-Occludin抗体(abl67161),辣根过氧增,每种组织为EFHD2及内参p-actin各重复3次。
化物酶标记(HRP)的山羊抗兔IgG二抗(ab6728),并对qPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。用2"act法
AlexaFluor488标记的山羊抗兔IgG(abl50113),分析实验数据,计算mRNA表达水平。
AlexaFluor594标记的山羊抗鼠IgG(訪150116)
Biosharp兰杰柯科技有限公司:PBS缓冲液蛋白表达水平分别取5只小鼠心、肝、脾、肺、肾、
(BL601A)、TBS缓冲液(BL602A)。翌圣生物科技脑、睾丸、卵巢等组织,各取50mg加入1mlRIPA
(上海)股份有限公司:HieffqPCRSYBRGreenMas­裂解液,用玻璃研磨器研磨组织,抽提蛋白。经
terMix(11202ES08)、HifairIII1stStrandcDNASyn­SDS-PAGE电泳、转膜、5%BSA封闭2h,孵育一抗
thesisKit(11139ES10)、碘化丙®(40711ES10)。(1:1000,4七过夜),TBST洗膜10min/次,重复3
TRIzol试剂(15596026)ALipofectamine™2000转染次,孵育二抗(1:20000,室温1h),使用ECL化学
试剂(美国赛默飞世尔科技公司)。RIPA组织裂解发光试剂发光,Bio-Rad成像系统拍照。使用Image
液(P0013B,上海碧云天生物技术有限公司)。Anti-J进行灰度分析,对灰度值进行统计学分析。
P-actin抗体(#4970,
司)。5只小鼠睾丸组织经Bouin,s液固定、石蜡包埋、切
,10片、抗原修复、%TritonX-100打孔、5%BSA封
周龄,体质量(20±2)g,购自大理大学实验动物中闭、一抗(1:500)4七孵育过夜,二抗(1:1000)孵
心。于温度22~26兀、湿度40%-60%环境中饲育1h,DAB试剂显色,苏木精复染,光镜观察EF-
养,自由饮食、饮水。TM4细胞即正常小鼠SertoliHD2在睾丸中的定位和分布情况,并且拍照。
细胞,获赠于上海交通大学刘悦老师。
14方法Vimentin共定位情况取新鲜睾丸组织进行冰冻切
-PCR片。***固定15min,%TritonX-100打孔,5%
所需引物,引物序列见表1。EFHD2的siRNA由生BSA封闭,一部分切片一抗(1:500)4七过夜。二
工生物工程(上海)股份有限公司代设计,序列见表抗(1:1000)孵育2h,PI染色荧光显微镜下观察该
2,并且引物也一并由该公司合成。蛋白在睾丸组织中的分布并且拍照。另一部分切片
-PCR检测EFHD2在各器官组织中mR-进行Anti-EFHD2抗体和Anti-Vimentin抗体双染
NA水平的表达分别取5只小鼠心、肝、脾、肺、色,镜下观察EFHD2和Vimentin共定位情况。
肾、脑、睾丸等组织,用手持均质器研磨组织,
TRIzol法提取各组织总RNA,反转录成cDNA,并对TM4细胞接种于6孔板。设置5个组,空白对照
•1746•安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2022Nov;57(11)
组、阴性对照组、3个干扰序列组。「
40%时,使用Lipofectamine™2000试剂转染siRNA,-
*-
siRNA终浓度为30nmol/Lo转染24h时,使用TR-故
-***
K
-
--n
时使用RIPA裂解液提取蛋白。
Q2・0丁
-PCR检测干扰后各组EFHD2相对表
达量提取各组细胞的总RNA后,逆转录成cD-
NA,接着进行qPCR。随后,运用2"
数据,计算mRNA表达水平。0
ab
BbpMarkerabcdegabcde
的EFHD2和Occludin的相对表达量提取后的细gbp
胞蛋白,经SDS-PAGE电泳、转膜、5%BSA封闭2h,
400
孵育一抗(1:1000,4七过夜),TBST洗膜10min/350
次,重复3次,孵育二抗(1:20000,室温1h),ECL
化学发光试剂发光,Bio-Rad成像系统拍照。用Im­
ageJ进行灰度分析,对灰度值进行统计学分析。EFHD2GAPDH
(A)
行数据分析,两组之间运用t检验,结果值以令土$表与qPCR后电泳结果(B)
:心;:肝;:脾;:肺;:肾;:脑;:睾丸;:;
示。以P<。abcdefgEFHD2100bp
GAPDH:133bp;与肝脏组织比较:***P<
2结果
ABCDEFGku
示:EFHD2在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和睾丸等器EFHD227
官组织中均有不同程度的表达,肝和脑中表达量较
其他组织高,在睾丸中最高(图1A),差异有统计学
P-actin
意义(P<)o对qPCR产物进行琼脂糖凝胶电45
泳,结果说明qPCR扩增具有特异性(图1B)。
*
验结果显示:EFHD2蛋白在小鼠心、肝、脾、肺、肾、敢畴英
脑和睾丸组织中均有表达,在肝脏、脑和睾丸组织中
表达量较高(图2)。wHHGCwylg
定位情况用免疫组化技术检测EFHD2蛋白在睾
丸组织中的分布情况,结果显示:Sertoli细胞的胞质
周边着色较深,而生精细胞和睾丸间质细胞着色较
浅。这表明EFHD2蛋白主要分布于Sertoli细胞
(图3)。图2Westernblot法检测各器官组织中EFHD2蛋白的表达
:心;B:肝;C:脾;D:肺;E:肾;F:脑;G:睾丸;与肝组织比
况对小鼠睾丸组织进一步进行间接免疫荧光检较:**P<
测,结果和免疫酶标记的检测结果一致,荧光在Ser­EFHD2确实是在Sertoli细胞表达的(图4)。
toli细胞中着色较深,
细胞。此夕卜,还采取了与Vimentin免疫荧光共定位对表达量在进行干扰后6h,对携带绿色荧光蛋白
检测,结果显示:EFHD2和Vimentin(Sertoli细胞特(GFP)的阴性对照序列进行转染效率观察(图5),
异性蛋白)在Sertoli细胞中荧光染色重叠,验证可以观察到已成功将siRNA转染进TM4细胞。对
安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2022Nov;57(ll)•1747•
图3免疫酶技术检测EFHD2在小歸睾丸中的定位情况
A、B:EFHD2在小鼠睾丸中的定位;C:不加一抗的对照组;A、C:x200;B:x400
EFHD2PIMerge
图4间接免疫荧光技术检测结果
A:EFHD2在小鼠睾丸中的表达情况x400;B:EFHD2和Vimentin在小鼠睾丸中共定位情况x400
qRT-PCR检测结果进行统计学分析,结果显示(图过各种细胞连接来调节生精细胞的各种状态Sertoli
5B),空白对照组和阴性对照组EFHD2相对表达量细胞底部和基膜相连,构成血睾屏障(blootbtestis
相近,两组比较差异无统计学意义。mEFHD2-308barrier,BTB)的一部分。BTB的完整为精子发生提
与阴性对照组比较表达下降,差异有统计学意义(P供一个稳定的微环境,血睾屏障的不完整将会影响
<)o精子的发生⑸。细胞连接中的紧密连接、锚定连接
­和桥粒连接是BTB的主要组成成分⑹。并且,细胞
cludin的相对表达量Westernblot结果显示(图连接周期性的清除和形成是生精细胞向生精小管管
6),mEFHD2-308的EFHD2蛋白表达量较其他组下腔运动的基础E。细胞连接的清除可以让生精细
将较明显,差异有统计学意义(P<)o进一胞分裂和向管腔运动,细胞连接形成后,生精细胞接
步检测紧密连接蛋白成分Occludin的相对表达量,收Sertoli细胞提供的营养物质进行物质合成,为下
空白对照组和阴性对照组差异无统计学意义;同样个细胞周期做准备。Sertoli细胞的稳态是正常生精
是mEFHD2-308的下降较其他组明显,差异有统计的基础。Sertoli细胞的细胞连接调控涉及多个方
学意义(P<)o面。其中细胞骨架成分,如微丝、微管、中间丝及其
相关的波形蛋白(Vimentin)等多种蛋白,可通过支
3讨论
持、黏附、信号传导等方式促进和维持SC的连接结
Sertoli细胞与生精细胞有着各种细胞连接,通构[8创。细胞连接结构的清除和形成依赖支持细胞
•1748•安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2022Nov;57(11)
GFPTM4Merge
*
坦來1
图5siRNA转染效率及各组EFHD2相对表达量xl00
fe
餐A:空白对照组;B:阴性对照组;C:mEFHD2-731组;D:
S/KG
OmEFHD2474组;E:mEFHD2-308组;与阴性对照组比较:
*P<
输需要细胞骨架蛋白的参与O
ABCDEku紧密连接是构成血睾屏障的主要结构之一,而
Occludin—L*59
紧密连接有好几种蛋白构成,有Occludin、Z0-1、
Claudin等成分[⑵。研究[⑶显示,敲除Occludin的
EFHD2—-■—27
小鼠出现了不同程度的生精障碍。
结合Sertoli细胞连接需要周期性的清除和形
成,来维持正常的生精过程。推测EFHD2参与Ser­
toli细胞连接的周期性清除和生成。EFHD2对Ser-
toli细胞内肌动蛋白和骨架蛋白的调节,影响了Ser­
啊故嵌茯廷
toli细胞的细胞连接的周期性开放,从而影响生精细
胞的发育。EFHD2的正常存在对正常生精环境的
维持起到了不可或缺的作用。因此本研究观察EF-
-In
嘲HD2在睾丸中的表达和定位,实验结果验证了推
测,EFHD2蛋白在睾丸中表达水平较一般组织要
高,且定位在支持细胞(与Sertoli细胞特异性蛋白
Vimentin定位一致)。接着成功地进行了TM4细胞
图6Westernblot法检测siRNA干扰48h后
的siRNA干扰,检测Occludin蛋白和EFHD2蛋白
各组EFHD2和Occludin的表达
一样呈下降趋势,验证了在细胞层面,EFHD2和Oc­
A:阴性对照组;B:mEFHD2-731组;C:mEFHD2474组;D:
mEFHD2-308组;E:空白对照组;与阴性对照组比较:****P<cludin的合成是有关联的。Occludin作为BTB和紧
,BTB和紧密连接对精子的发生
又十分的重要,那么Occludin在Sertoli细胞的表达
。本研究明确了EFHD2
还依赖于细胞内吞作用和囊泡运输过程,如通过细在小鼠睾丸中的定位及对细胞紧密连接蛋白Occlu­
胞内吞作用清除细胞连接处的连接蛋白可破坏细胞din形成的影响,阐明了EFHD2蛋白维持Sertoli细
连接结构;而连接蛋白随着囊泡运输重新与细胞膜胞的稳态起到了重要作用,为继续研究EFHD2在睾
融合可在该处形成新的细胞连接。而内吞和囊泡运丸中的作用奠定了基础。
安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2022Nov;57(11)・1749・
2022,121:125-32.
参考文献[7]Gungor-OrdueriNE,TangEI,Celik-OzenciC,
actinbindingproteinthatregulatessertolicellandspermatidadhe­
[1]MunSA,ParkJ,ParkKR,
sionduringspermatogenesis[J].Endocrinology,2014,155:3981
characlerizalionofEFhdl/Swiprosin-2,anactin-bindingprotein
-95.
inmitochondria[J].FrontCellDevBiol,2020,8:628222.
[8]MokKW,MrukDD,LeeWM,­
[2]RegensburgerM,ProtsI,ReimerD,-1/
latesblood-leslisbarrierdynamicsviaitseffectsongapjunction
EFHD2onadulthippocampalneurogenesis[J].StemCellRe­
communicationsandactinfilamentnetwork[J].FASEBJ,2013,
ports,2018,10:347-55.
27(3):1137-52.
[3]TuY,ZhangL,TongL,-1regulatesLPS-
[9]VoglAW,VaidKS,
inducedmacrophagerecruitmentviaenhancingactinpolymeriza­
[J],AdvExpMedBiol,2008,636:186-211.
tionandcellmigration[J].Intlmmunopharmacol,2018,55:263
[10]SmithLB,MilneL,NelsonN,­
-71.
tolicellmicrotubuledynamicsisessentialforspermiogenesisand
[4]SolimanAS,UmsteadA,GrabinskiT,-
malefertility[J].PLoSGenet,2012,8:el002697.
tomerevealsitsassociationwithdifferentcellularandmolecular
[11]GiriczZ,MakkosA,SchreckenbergR,-l/EFhD-2
processes[J].JNeurochem,2021,159:992-1007.
expressionincardiacremodelingandpost-infarctrepair:Effectof
[5]ChungNP,-inducedinter-sertoli
ischemicconditioningfJ].IntJMolSci,2020,21(9):3359.
tightjunctionpermeabilitybarrierdisruptionasuitableinvitro
[12]Jauregi-
modeltostudytheeventsofjunctiondisassemblyduringspermato­
coeliacdisease[J].IntRevCellMolBiol,2021,358:105-32.
genesisintherattestis?[J].Endocrinology,2001,142(5):
[13]MorrowCMK,MrukD,ChengCY,
1878-88.
expressionandfunctionintheseminiferousepithelium[J].Philos
[6]WuX,GaoS,WangL,
TransRSocLondBBiolSci,2010,365(1546):1679-96.
inhumanspermatogenesis-insightsfromstudiesinrodentsand
scRNA-Seqtranscriptomeprofiling[J].SeminCellDevBiol,
EffectsofEFHD2proteindeletionontightjunction
proteinsinmouseSertolicells
YeXiaolin1,XuGuolin1,QianTijun2,QinFeng2,WangYuntao1,ChengYuhang3,ZhaoWenzhen1
(1DeptofHistologyandEmbryology,2InstituteofPathogensandVectors,SchoolofBasicMedicalSciences,
DaliUniversity,Dali671000;3GraJe2018ClinicalMedicineMajorofDaliUniversity,Dali671000)
AbstractObjectiveTostudytheeffectofEFHD2proteindeletioninSertolicellsonOccludin,acomponentof
tightjunctionproteinandthelocalizationandexpressionofEF-handdomainfamilymemberD2(EFHD2)inmouse
'sheart,liver,spleen,lung,kidney,
-PCR
andWesternblo