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专利名称:监视亚硫酸氢盐介导的dna转化的方法
技术领域:
本发明涉及在DNA***化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的方法。所述方法基于酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)与至少一种标记的DNA报告分子的反应,所述报告分子在其序列中包含至少一个未***化的胞嘧啶残基。在尿苷残基中未***化的胞嘧啶残基的亚硫酸氢盐介导的转化之后,UNG从DNA骨架中除去尿嘧啶碱基,因而使得它对热诱导的水解切割敏感。最后,检测在这种断裂过程期间从DNA报告分子上释放的标记物。尿嘧啶-DNA糖基化酶和尿嘧啶-N-糖基化酶有时缩写为UNG或UDG,它们应被理解为相似的或同义的。在任何情况下,在本申请中使用该术语来指明使得DNA骨架对热诱导的水解切割敏感的酶。
背景技术:
DNA***化在各种生物体包括原核生物和真核生物的基因组中存在。在原核生物中,DNA***化在胞嘧啶和腺嘌呤碱基上发生,并涵盖了宿主限制系统的一部分。然而在多细胞真核生物中,***化看起来限于胞嘧啶碱基,并且与被抑制的染色质状态和基因表达抑制相关(例如,在Wilson,,.(199lM//,585-627中综述)。在哺乳动物细胞中,DNA***化主要在CpG
二核苷酸处发生,其不均勻地分布,并且在基因组中减量出现(underr印resented)。在许多启动子区域中发现了通常未***化的CpGs的簇(称为CpG岛)(例如,在Li,E.(2002)#,662-673中综述)。已经在几种人类癌症中证明了引起异常的基因沉默的DNA***化的改变(例如,在Robertson,,.(2000),11-19中综述)。证明了启动子的超***化是引起肿瘤阻抑基因灭活的常见的机制(Bird,.(2002)^,6-21)。存在各种方法用于实验上测定个体基因中的差异性***化(例如,在Rein,,2255_2洸4中综述)。这些技术尤其地包括亚硫酸氢盐测序、***化特异性PCR(MSP)、Methylight和焦磷酸测序。进行上述技术的一个共同的先决条件是要分析的DNA的亚硫酸氢盐介导的转化(也称为亚硫酸氢盐修饰)。特别地,未***化的胞嘧啶残基被转变为尿苷残基。从胞嘧啶到尿嘧啶的亚硫酸氢盐介导的转化的三步骤反应方案在
图1中示意地显示。简言之,在微酸性条件下胞嘧啶被磺化为胞嘧啶亚硫酸氢盐。自发地发生水解脱氨成为尿嘧啶-亚硫酸氢盐。后者然后在碱性条件下脱磺酸成尿嘧啶。由于在亚硫酸氢盐处理期间***化的胞嘧啶残基不被转化为尿苷残基,未***化的CpG岛中的DNA序列被有效地改变(C到U),而***化的
DNA保持了它的原始序列。然而,对于基于DNA***化状态分析的有效的诊断结果,希望的是DNA以最大效率转化,也就是说理想地,给定DNA序列中存在的100%的未***化的胞嘧啶残基转化为尿苷残基。
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亚硫酸氢盐介导的DNA转化一般使用商业上可获得的反应试剂盒进行。在这些测试系统中,DNA通常在相对高的反应温度(例如,60°C)下孵育长时间(在很多情况下,过夜)。在孵育的这个时间期间,重复的加热步骤到95°C是变性DNA所必需的。在很多情况下,通过简单地使得反应运行看来适当的尽量多次,孵育时间应当达到最高的DNA转化效率,和/或孵育时间是可容忍的,同时维持一定水平的DNA质量。另一方面,还明显的是,延长的加热时期最后引起DNA的降解,因而引起DNA产量和完整性的降低。这对于任何下游的分析可能是致命的,例如,如果样品中的DNA浓度低的话。然而,要分析的不同的样品DNA或不同的应用可能需要独特的实验设置,以实现最大效率。例如,与纯化的样品DNA相比,使用具有非纯化DNA的粗溶胞产物具有更高的不确定性。在粗溶胞产物中,存在着可能潜在地与亚硫酸氢盐相互作用的其他物质,因而干扰DNA转化反应。鉴于上述考虑,“一个孵育时间满足所有情况”的一般方法显然是不合理的,因为当分析易于转化的DNA样品(例如,纯化的DNA分子)时,这将由于延长的热暴露而引起不必要的
DNA质量损失。反之亦然,即使有的话,复杂样品(例如,粗溶胞产物、体液、冷冻的活检组织)中的DNA可能仅相当小程度地被转化。当前,还没有主动地监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的进行和发展的方法。然而,提供这样的方法将帮助精确地确定每个单独反应的终点(即,100%完成),因而容许从一般化的方案变为样品特异性的反应条件。可以避免不必要的和过度的加热孵育时间,从而改
善DNA质量。因而,对于克服上述限制、容许精确监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的方法存在着持续的需求。特别地,需要相应的方法,其允许为分析的每个样品DNA设置个体化的反应条件,从而改善差异化DNA***化分析的结果。发明概述
本发明的一个目的是提供用于在DNA***化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的新的方法。更具体地,一个目的是提供容许转化终点的精确测定的方法。此外,一个目的是提供一种方法,其允许反应条件的精确控制以及匹配,所述反应条件应用于所采用的样品DNA的特定要求,从而引起获得的DNA质量的总体改善。这些目的以及根据确保性描述将变得显而易见的其他目的通过独立权利要求的主题来实现。本发明的某些优选的实施方式由从属权利要求的主题来限定。在一个方面中,本发明涉及在DNA***化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的
DNA转化的方法,包括
(a)提供要分析的样品DNA和至少一种DNA报告分子,其中所述至少一种DNA报告分子包含
(i)在它的核苷酸序列中至少一个未***化的胞嘧啶残基;以及
(ii)至少一种标记物(label);
以及其中所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子在相互流体连接的、空间上分隔的反应区室中提供;
(b)向所述空间上分隔的反应区室添加亚硫酸氢盐,从而介导所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子的核苷酸序列中包含的未***化的胞嘧啶残基向尿苷残基的转化;
(c)向所述至少一种DNA报告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶,从而介导步骤(b)中获得的尿嘧啶碱基从DNA骨架上脱除;
(d)通过热处理来断裂步骤(c)中获得的DNA;以及
(e)检测在步骤(d)期间从所述至少一种合成的DNA报告分子释放的至少一种标记物。在一个实施方式中,所述方法进一步包括
(f)将(e)中获得的结果与参考值比较。在另一个实施方式中,检测步骤在给定的时期内重复至少一次。优选地,步骤(e)中获得的结果用于控制根据步骤(b)的反应的发展。在优选的实施方式中,所述至少一种DNA报告分子是合成的寡核苷酸。在特别优选的实施方式中,所述至少一种合成的
DNA报告分子被固定在支持物上。在另一个优选的实施方式中,所述尿嘧啶-DNA-糖基化酶是热稳定的。在一个具体的实施方式中,步骤(c)、(d)和(e)在提供所述至少一种DNA报告分子所采用的同一反应区室中进行。在可选择的实施方式中,步骤(c)、(d)和(e)中的任一个或多个在至少一个进一步的空间上分隔的反应区室中进行,所述反应区室与提供所述至少一种DNA报告分子所采用的反应区室是流体连接的。在进一步具体的实施方式中,至少任何一个,并且优选地,所有反应区室装备有一个或更多个温度控制单元,用于控制和调节反应区室内的温度。在优选的实施方式中,反应区室之间的空间分隔通过半透膜、优选地大小排阻膜或微量渗析膜的方式实现。在进一步优选的实施方式中,相互流体连接的至少两个空间上分隔的反应区室被整合到传感设备、优选地连续传感设备中。在另一个方面,本发明涉及在此限定的方法用于分析样品DNA的***化状态的用途。优选地,进行DNA***化状态的分析用于诊断癌症。图简述
图1示意地描绘了从胞嘧啶(左侧)到尿嘧啶(右侧)的亚硫酸氢盐介导的转化的一般的三步骤反应方案。在微酸性条件下胞嘧啶被磺化为胞嘧啶-亚硫酸氢盐。自发地发生水解脱氨成为尿嘧啶-亚硫酸氢盐。后者然后在碱性条件下脱磺酸成尿嘧啶。图2示意地描绘了在DNA的延伸中在尿苷残基上尿嘧啶
-DNA-糖基化酶(UNG)的反应。如果胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶,尿苷残基仅可在DNA中存在,引起DNA中的突变。UNG从DNA的糖-磷酸骨架上除去尿嘧啶碱基。虽然DNA骨架保持完整,产生的无碱基位点对于提高温度下的水解切割是敏感的。图3示意地描绘了根据本发明的方法的原理。提供的是至少一种标记的DNA报告分子,在它的核苷酸序列中包含未***化的胞嘧啶残基,所述胞嘧啶残基通过添加重硫酸盐的方式转化为尿苷残基(1.)。用UNG处理DNA引起尿嘧啶碱基从DNA骨架上脱除(2.),因而使得它在这些无碱基位点对热诱导的断裂敏感(3.)。任选地分离从至少一种DNA报告分子上释放的标记物(4.),并通过合适的分析方法来检测。图4描绘了在示范性的传感设备中进行的根据本发明方法的一个实施方式的示意图,所述传感设备具有相互流体连接的至少五个空间上分隔的反应区室。这个实施方式的详细说明在实施例1中给出。图5示意地描绘了在具有相互流体连接的至少两个空间上分隔的反应区室的示范性的传感设备中,通过利用固定在固相支持物(即,珠子表面)上的DNA报告分子的部分,离散的数据点的采集。图A-C说明了部分释放的示意性的时间系列。图D代表了测定DNA转化效力的可能的曲线。细节在实施例3中给出。图6描绘了在示范性的传感设备中进行的根据本发明方法的另一个实施方式的示意图,所述传感设备具有相互流体连接的至少两个分隔的反应区室。采用的一种
DNA报告分子固定在反应区室之一的表面上。图A说明了样品DNA和DNA报告分子的亚硫酸氢盐介导的转化。图B显示了在适合的温度和缓冲条件下从储存器添加UNG。图C显示了“转化的”DNA报告分子的热诱导的断裂。这个实施方式的详细说明在实施例4中给出。图7描绘了在示范性的传感设备中进行的根据本发明方法的进一步的实施方式的示意图,所述传感设备具有相互流体连接的至少两个分隔的反应区室。使用的UNG酶是热稳定的,因而可以与至少一种DNA报告分子一起提供,所述DNA报告分子固定在反应区室之一的表面上。这个实施方式的详细说明在实施例5中给出。详细说明
本发明基于出乎意料地发现,通过组合酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)与至少一种标记的DNA报告分子的反应,报告分子在它的序列中包含至少一个未***化的胞嘧啶残基,可以建立用于在DNA***化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的有效的方法。在下文说明性描述的本发明可以在缺少没有在此具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当进行。将针对特定的实施方式和参考某些图描述本发明,但是本发明不受此限制,而是仅由权利要求限制。描述的图仅是示意性的并被认为是非限制性的。当术语“包括”在本说明书和权利要求中使用时,它不排除其他要素或步骤。对于本发明的目的,术语“由……组成
”被认为是术语“包含”的优选的实施方式。如果在下文中,某一组被限定为包含至少一定数量的实施方式,这也被理解为公开了一种组,其优选地仅由这些实施方式组成。在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词例如“一(a、an)”、“该(the)”的情况下,这包括该名词的复数,除非特别声明了其他情况。在本发明的上下文中术语“约”表示精确性的区间,本领域的技术人员将理解仍然确保了所讨论的特征的技术效果。该术语一般表明从所指明数值的士10%和优选地士5%的偏离。此外,在说明书中和在权利要求中,术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等等,是用于区分相似的要素,而不必描述次序或时间顺序。要理解的是,这样使用的术语在合适的状况下是可互换的,且在此描述的本发明的实施方式能够以不同于在此描述或说明的其他顺序来操作。术语的进一步的定义将在以下在使用该术语的上下文中给出。单独地提供以下术语或定义来帮助理解本发明。这些定义不应当被认为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
在一个方面,本发明涉及在DNA***化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的方法,包括
(a)提供要分析的样品DNA和至少一种DNA报告分子,其中所述至少一种DNA报告分子包含
(i)在它的核苷酸序列中至少一个未***化的胞嘧啶残基;以及
(ii)至少一种标记物;
以及其中所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子在相互流体连接的、空间上分隔的反应区室中提供;
(b)向所述空间上分隔的反应区室添加亚硫酸氢盐,从而介导所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子的核苷酸序列中包含的未***化的胞嘧啶残基向尿苷残基的转化;
(c)向所述至少一种DNA报告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶,从而介导步骤(b)中获得的尿嘧啶碱基从DNA骨架上脱除;
(d)通过热处理来断裂步骤(c)中获得的DNA;以及
(e)检测在步骤(d)期间从所述至少一种合成的DNA报告分子释放的至少一种标记物。如在此使用的,术语“样品DNA”是指包含一个或更多个DNA分子的任何样品,一旦DNA分子的核苷酸序列中包含的未***化的胞嘧啶残基被转化成尿苷残基,则要分析所述DNA分子的差异***化状态。DNA分子可以是天然发生的或合成的化合物(例如,通过重组DNA技术或通过化学合成产生的),且可以是单链的或双链的。DNA分子可以具有任何长度。一般地,长度在10bp到100000bp之间变动,优选在100bp到10000bp之间,特别优选在500bp到5000bp之间。样品DNA中包含的DNA分子可以以纯化的形式存在(例如,在适合的缓冲溶液中提供的,例如本领域已知的TE或PBS),或可以包括在未纯化的、部分纯化的或富集的样品溶液中。这样的未纯化的样品的实例包括粗的细胞溶胞产物、体液