用于生产感兴趣的重组多肽的方法.docx

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专利名称:用于生产感兴趣的重组多肽的方法
技术领域:
本发明涉及用于生产感兴趣的重组多肽的方法,通过所述方法获得的多肽,重组多核苷酸、表达载体、表达构建体,以及特定信号肽用于生产感兴趣的重组多肽的用途和编码所述特定信号肽的多核苷酸用于生产感兴趣的重组多肽的用途。
背景技术:
丝状真菌宿主细胞中重组多肽的生产是本领域已知的。目前多肽的生产以多种方式进行。用于生产重组多肽的现有技术方法是通过发酵包含表达构建体的宿主细胞进行的,所述表达构建体包含与编码感兴趣的多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子等等。为了将感兴趣的多肽导向宿主细胞的分泌途径,感兴趣的多肽包含信号序列。在Broekhuijsenetal(JournalofBiotechnology,31(1993)135-145,Broekhuijsenetal;SecretionofheterologousproteinsbyAspergillusnigerProductionofactivehumaninterleukin-6inaproteasedeficientmutantbyKEX2_likeprocessingofaglucoamylase-hIL6fusionprotein)中,使用分泌型多肽葡糖淀粉酶的信号序列在Aspergillusniger中表达重组蛋白质。在工业背景下,需要生产的多肽的高产量。可以通过提高分泌效率来增强感兴趣的重组多肽的生产产量。因此
,为了增强感兴趣的多肽的生产产量,需要改进分泌效率。本发明的一个目的是提供改进的用于生产重组多肽的方法。
图1描绘了表达载体pGBFINFUA-1(描述于W02008/000632中)的质粒图谱。pGBFINFUA-Ι对于质粒pGBFINFUA_3和pGBFINFUA_21来说也是代表性的。相对于amyB启动子序列和编码引入了变体信号序列的α-,标出了glaA侧翼区。,。图2描绘了表达载体pGBFINFUA-6(构建描述于实施例1中)的质粒图谱。pGBFINFUA-6对于质粒pGBFINFUA-8、pGBFINFUA-11、pGBFINFUA-12、pGBFINFUA-13、pGBFINFUA-15、pGBFINFUA-16和pGBFINFUA_18来说也是代表性的。相对于glaA启动子和编码引入了变体信号序列的α-,标出了glaA侧翼区。,。图3描绘了通过单同源重组整合的图示。表达载体包含可选择的amdS标记物,和与amyB基因连接的启动子,所述启动子含有变体信号序列。这些特征侧翼是指导在基因组glaA基因座处整合的glaA基因座的同源区(分别为3’glaA和3”glaA)。
菌株培养液中的α-淀粉酶活性,所有amyB构建体均位于glaA启动子的控制下。-淀粉酶活性,其中不同构建体中的信号序列已被修饰。关于不同构建体的细节可见表1。以相对α-淀粉酶单位[AU]为单位描述α-淀粉酶活性,其中第3天FUA6组3个菌株的FUA-6单拷贝菌株的均值被设为100%。对指出的所有转化体组而言,分离并独
立培养三个转化体。-淀粉酶活性,所述两种不同的amyB构建体均位于amyB启动子的控制下。描述了表达天然amyB构建体(pGBFINFUA-3)-淀粉酶活性,其中根据本发明的方法将amyB信号序列修饰成了经密码子优化的pmeA信号序列(pGBFINFUA_21)。关于两种构建体的细节可见表2。以相对α-淀粉酶单位[AU]为单位描述α-淀粉酶活性,以第3天FUA3组3个菌株的FUA-3-1单拷贝菌株的均值设为100%。对指出的两个转化体组而言,分离并独立培养三个转化体。,所述两种不同的构建体均位于glaA启动子的控制下。描述了表达天然goxA构建体(G0X-l-#),其中根据本发明的方法将经密码子优化的goxA
信号序列修饰成了经密码子优化的pmeA信号序列(G0X-2-#)。以相对葡萄糖氧化酶单位[AU]为单位描述葡萄糖氧化酶活性。对指出的两个转化体组而言,分离并独立培养五个转化体。发明详述令人惊讶地,我们确定,可以通过使用特定的信号序列改进感兴趣的重组多肽的生产。因此,本发明在第一方面提供了用于生产感兴趣的重组多肽的方法,所述方法包括(i)在有助于生产所述多肽的条件下培养丝状真菌宿主细胞,所述丝状真菌宿主细胞包含以符合翻译读码框的方式与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,所述第二多核苷酸编码感兴趣的多肽,所述第一多核苷酸编码选自下组的信号肽,所述组由a)SEQIDNO25,b)15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO25的前10个氨基酸在相应位置上相同,c)15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨
基酸,d)SEQIDNO39,e)15到23个氨基酸的SEQIDNO39的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO39的前10个氨基酸在相应位置上相同,f)15到23个氨基酸的SEQIDNO39的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨
基酸,g)SEQIDNO44,h)15到23个氨基酸的SEQIDNO44的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO44的前10个氨基酸在相应位置上相同,i)15到23个氨基酸的SEQIDNO:44的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸,j)SEQIDNO:34,k)15到23个氨基酸的SEQIDNO34的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO34的前10个氨基酸在相应位置上相同,1)15到23个氨基酸的SEQIDNO:34的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸构成,(ii)以及任选地,从培养基分离所述多肽。上文所述方法在本文中被称作根据本发明的方法。根据一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是SEQIDNO:25。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是15到23个氨基酸的SEQIDNO:25的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO:25的前10个氨基酸在相应位置上相同。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是SEQIDNO:39。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是
15到23个氨基酸的SEQIDNO39的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO39的前10个氨基酸在相应位置上相同。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是15到23个氨基酸的SEQIDNO39的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是SEQIDNO:44。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是15到23个氨基酸的SEQIDNO44的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO44的前10个氨基酸在相应位置上相同。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是15到23个氨基酸的SEQIDNO44的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是SEQIDNO:34。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是15到23个氨基酸的SEQIDNO34的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO34的前10个氨基酸在相应位置上相同。根据另一个实施方案,在本发明的方法中,信号肽是15到23个氨基酸的SEQIDNO34的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸。优选地,在根据本发明的方法中
,当信号肽是以下时a)SEQIDNO25,b)15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO25的前10个氨基酸在相应位置上相同,或c)15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨
感兴趣的多肽不是果胶***酯酶,更优选地感兴趣的多肽不是来自Erwiniachrysanthemi的果胶***酯酶。更优选地,当信号肽是(b)或(c)时,感兴趣的多肽不是果胶***酯酶,进一步更优选地感兴趣的多肽不是来自Erwiniachrysanthemi的果胶***酯酶。优选地,编码SEQIDNO25时,第一多核苷酸是根据SEQIDNO29的多核苷酸。优选地,编码SEQIDNO39时,第一多核苷酸是根据SEQIDNO38的多核苷酸。优选地,编码SEQIDNO:44时,第一多核苷酸是根据SEQIDNO:43的多核苷酸。优选地,编码SEQIDNO34时,第一多核苷酸是根据SEQIDNO33的多核苷酸。优选地,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO25的前10个氨基酸在相应位置上相同的、15到23个氨基酸的SEQIDNO:25变体是下述变体,其中至少9个氨基酸与SEQIDNO25的前10个氨基酸在相应位置上相同。更优选地,10个氨基酸与SEQIDNO25的前10个氨基酸在相应位置上相同。优选地,其中第1位的氨基酸是Met、第2位的氨基酸是Val
或Lys、并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸的、15到23个氨基酸的SEQIDNO25变体是选自下组的变体a)15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2、3和/或4位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸,b)15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val,第3位的氨基酸是Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸,c)15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2、3和/或4位的氨基酸是Val或Lys,其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸,并且其中变体最后三个位置上的氨基酸是Ala、Leu和Ala,d)15到23个氨基酸的SEQIDNO25的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val,第3位的氨基酸是Lys,其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸,并且其中变体最后三个位置上的氨基酸是Ala、Leu和Ala。优选地,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO:39的前10个氨基酸在相应位置上相同的、15到23个氨基酸的SEQIDNO:39的变体是下述变体,其中至少9个氨基酸与SEQIDNO39的前10个氨基酸在相应位置上相同。更优选地,10个氨基酸与SEQIDNO39的前10个氨基酸在相应位置上相同。优选地,其中第
1位的氨基酸是Met、第2位的氨基酸是Val或Lys、并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸的、15到23个氨基酸的SEQIDNO39的变体是选自下组的变体a)15到23个氨基酸的SEQIDNO39的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2、3和/或5位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸,b)15到23个氨基酸的SEQIDNO39的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2位的氨基酸是Val,第5位的氨基酸是Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸。优选地,其中至少8个氨基酸与SEQIDNO:44的前10个氨基酸在相应位置上相同的、15到23个氨基酸的SEQIDNO:44的变体是下述变体,其中至少9个氨基酸与SEQIDNO44的前10个氨基酸在相应位置上相同。更优选地,10个氨基酸与SEQIDNO44的前10个氨基酸在相应位置上相同。优选地,其中第1位的氨基酸是Met、第2位的氨基酸是Val或Lys、并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸的、15到23个氨基酸的SEQIDNO44的变体是选自下组的变体a)15到23个氨基酸的SEQIDNO44的变体,其中第1位的氨基酸是Met,第2、3和/或4位的氨基酸是Val或Lys,并且其中10个氨基酸的连续串包含至少5个选自Ala或Leu的氨基酸,b)15到23个氨基酸的SEQIDNO:44的变体,其中第