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专利名称:用于制备多肽的方法
技术领域:
本发明涉及一种用于在基因修饰的酵母菌株中制备多肽的方法。
背景技术:
用适宜的包含编码异源蛋白的DNA序列的表达载体转化酵母细胞后在酵母中表达所述蛋白已经成功地用于多种多肽,例如胰岛素前体、胰高血糖素、胰高血糖素样肽和它们的功能类似物。然而,经常发现表达产物是各种期望的具有不同的氨基酸链长度的多肽前体的异质混合物。这是因为酵母产生大量负责加工较大的前体分子以释放成熟多肽的蛋白水解酶。包括/和iKZ/基因产物在内的大量蛋白酶负责这样的酵母蛋白降解。使用他Z/破坏株用于重组体蛋白的表达早先已有描述。因此,EP341215和US6,103,515描述使用缺乏他Z/的酵母菌株用于产生不带碱性C-末端氨基酸的肽,例如hANP、EGF、结缔组织活化肽-III、水蛭素和水蛭素变体。大半已知的神经肽和内分泌肽是a-酰***化的,且在大多数情况下,此结构特征对受体识别、信号转导和因此对生物学功能是必不可少的。a-酰***化源自于C-末端甘氨酸,其被酶促转变为酰***。如果细胞具有用于体内a-酰***化的必要机器(machinery),那么可直接在生产细胞中生产a-酰***化肽。然而,包括酵母在内的一些有机体不能产生
a-酰***化,因为它们不表达用于体内a-酰***化的必要酶,因此通过细胞生产的肽不得不通过随后的体外步骤a-酰***化。如果酵母被用作重组体生产细胞,一个解决方案是生产带有C-末端甘氨酸的前体多肽,然后在随后的体外过程中用a-酰***化酶将其转变为a-酰***化肽((1994).C-Terminalamidatedpeptides:Productionbytheinvitroenzymaticamidationofglycineextendedpeptidesandtheimportanceoftheamidetobioactivity(C_末端酰***化肽通过甘氨酸延伸肽的体外酶促酰***化进行生产和酸***对生物活性的重要性).:16(450-456)。然而,意想不到地,本发明的发明人等已发现C-末端甘氨酸被从酿酒酵母{Saccharomycescerevisiae)表达的大量肽中切除,使得随后转化为a-酰***化肽不可倉泛。本发明通过使用不切除C-末端甘氨酸残基的基因修饰的酵母菌株提供一种针对该问题的解决方案。发明概沭
在一个方面,本发明涉及一种在酵母中制备带有C-末端Gly的多肽的方法,其中酵母菌株具有非功能性基因。可通过使用熟知的技术使於沈7基因无功能。因此,在一个实施方案中简单地缺失基因,而在另一个实施方案中通过位点特异突变(例如通过同源重组)使他Z/基因无功能。
在一个实施方案中,本发明涉及一种在具有非功能性基因的酵母菌株中制备多肽的方法,其中所述多肽具有甘氨酸作为其C-末端氨基酸残基,且其中所述方法包括以下步骤
a)将包含编码多肽的DNA序列的酵母菌株在用于在酵母菌株中表达多肽的条件下培养,和
b)分离表达的多肽。表达的多肽可从细胞培养物或从酵母细胞中分离,这取决于表达的多肽是否从酵母细胞中分泌。
如果C-末端倒数第二个氨基酸是以下氨基酸残基之一,那么C-末端甘氨酸特别不稳定Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg。因此,在一个实施方案中,C-末端倒数第二个氨基酸为Tyr>Phe、Met、Leu、Trp、Ala、lie或Arg。“C_末端倒数第二个氨基酸”意指与C-末端氨基酸残基(在该情形中是甘氨酸残基)的N-末端连接的氨基酸残基。特别地,当C-末端倒数第二个氨基酸是疏水氨基酸残基且特别是芳族氨基酸残基时,C-末端甘氨酸更不稳定。因此,在另一个实施方案中,与C-末端Gly邻接的氨基酸残基是Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、He或Met,和在另一个实施方案中,与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Val、Leu、Ile或Met,和在另一个实施方案中,与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr、Phe或Trp。在又一个实施方案中,与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr。除非功能性他Z/基因之外,酵母菌株可具有另外的非功能性蛋白酶基因。因此,在一个实施方案中,酵母菌株可具有至少一种选自
PEP4、YPSUMKC7,YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因。所述多肽的大小也可能是相关的,在另一个实施方案中,多肽在主链中具有约25至约75个氨基酸残基。在另一个实施方案中,多肽在主链中具有约25至约60个氨基酸残基,和在又一个实施方案中,多肽在主链中具有约25至约45个氨基酸残基。酵母菌株可以是任何能表达和分泌外源DNA的酵母菌株。然而,在一个实施方案中,酵母菌株是酿酒酵母菌株。本发明的方法可包括另外酶促转变表达和分泌的多肽。因此,在本发明一个实施方案中,通过在另外的体外步骤中用a-酰***化酶进行酶促转变,将带有C-末端Gly的表达和分泌的多肽转变为酰***。发明详述
如提到的,已证明在酿酒酵母菌株中带有C-末端甘氨酸的肽的表达是成问题的,因为甘氨酸被有效切除,特别是如果C-末端倒数第二个氨基酸是酪氨酸,如在PP(胰多肽)、PYY和淀粉状蛋白***(amylin)中,根据本发明,已发现在酵母菌株中负责切割C-末端甘氨酸的蛋白酶是Kexlp蛋白酶。“KexI”或“Kexlp”意指优先催化脱去C-末端赖氨酰和/或精氨酰残基的丝氨酸羧妝酶(ShiltonBH,ThomasDY,CyglerM1997CrystalstructureofKexldeltap,aprohormone-processingcarboxypeptidasefromSaccharomycescerevisiae(酉良酒酵母的激素原加工羧肽酶
KexlAp的晶体结构)Biochemistry36:9002-9012)。Kexlp或羧肽酶yscci是膜相关外肽酶,并在酵母中放毒者因子和交配因子的成熟中有重要作用。该酶对C-末端碱性氨基酸残基(Arg和Lys)有高的特异性。,:341-353(1994))使用脱硫水輕素(desulfato-hirudin)及其突变体作为模型底物进一步研究。本发明描述了使用具有非功能性於沈7基因的酵母菌株表达具有C-末端甘氨酸氨基酸残基的小肽。已显示该甘氨酸对Kexlp的切割非常不稳定,使得难以在酵母中有效表达这些肽。在该上下文中,“小肽”意指具有至多约75个氨基酸残基的肽。在一个实施方案中,所述肽具有至多约60个氨基酸残基,在另一个实施方案中,所述肽具有至多约50个氨基酸残基。在又一个实施方案中,所述肽具有约25至约45个氨基酸残基。本发明可生产的肽的说明性而非限制性实例是淀粉状蛋白***、淀粉状蛋白***类似物、PP和PP类似物、PYY和PYY类似物、GLP-I和GLP-I类似物、催产素、加压素、降钙素、胃泌素、NPY、FMRF酰***、分泌素、GFHR、CRF、神经激肽A、胃泌素释放肽和a-MSH。在一个实施方案中,可生产的肽选自具有与甘氨酸残基连接的芳族氨基酸残基的肽。因此,在一个实施方案中,所述肽选自胃泌素、NPY、FMRF酰***和淀粉状蛋白***及其类似物。表述“多肽”意在涵盖“肽”以及“蛋白”。本文使用的“类似物”意指具有形式上可通过缺失和
/或交换天然存在的多肽中存在的至少一个氨基酸残基从天然存在的多肽的结构衍生的分子结构的多肽。增加和/或交换的氨基酸残基可为可编码的氨基酸残基或者是其它天然存在的残基或者是完全合成的氨基酸残基。蛋白酶的活性可通过破坏编码蛋白酶的宿主基因来消除,从而产生丢失包括调节区和/或编码区在内的全部或部分蛋白酶基因的非回复型菌株,或备选地,活性可通过经典诱变步骤或通过引入特异性位点突变来降低或消除。使用经典技术破坏编码Kexlp蛋白酶的基因依赖同源重组,其中两个相似或相同链的DNA互换核苷酸序列。这允许将重组事件特异性地导向他Z/基因座,从而他’万开放阅读框与用于选择正确缺失的标记基因互换(,disruption,replacement,andallelerescue:integrativeDNAtransformationinyeast(祀向、破坏、置换和等位基因摇救酵母中的整合DNA转化):281-301)。在这样的一个方式中,用由侧翼为与他基因侧翼DNA序列同源的DNA序列的标记基因组成的线性DN***段(来自质粒或通过PCR产生)转化酵母菌株。成功的整合将用可选择的标记基因代替基因。适宜的标记是营养缺陷型标记例如URA3、HIS3、LEU2、TRPL或给予针对G418、潮霉素等的抗性的主要抗生素标记。可适用于下调蛋白酶活性的适宜的其它方法包括在酵母中引入反义构建体和
/或核酶构建体,例如Atkins等(AntisenseandDevelopment5:295-305,1995)和Nasr等(:51-57,1995)。Rothstein(MethodinEnzymoI,194:281-301,1991)描述了在酵母菌株中破坏他Z/基因的一个有用的方法。取决于期望的终产物,可对酵母宿主细胞进行进一步基因操作。作为实例,可使一个或多个另外的蛋白酶基因无功能。这样的蛋白酶基因的实例是、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6,YPS7、PRB1,STE13和KEX2。这对于避免表达的肽的额外降解可能是必要的。
在一个实施方案中,酵母菌株被敲除KEXl基因和选自PEP4、YPSl、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的一个蛋白酶基因。在另一个实施方案中,酵母菌株被敲除KEXl基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的两个蛋白酶基因。在另一个实施方案中,酵母菌株被敲除KEXl基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的三个蛋白酶基因。在另一个实施方案中,酵母菌株被敲除KEXl基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRBl、STE13和KEX2的四个蛋白酶基因。在一个实施方案中,使iKZ/和/基因无功能。这样的酵母菌株特别适宜用于表达带有C-末端甘氨酸的淀粉状蛋白***、PP和PYY及其类似物。在另一个实施方案中,酵母菌株具有破坏的基因和破坏的酵母天冬氨酰蛋白酶
3(Yap3p)基因{YPS1)。破坏酵母天冬氨酰蛋白酶3(Yap3p)基因在WO95/23857中被描述用于生产重组人白蛋白(rHA),和在描述生产短链多肽的US6,110,703中有述。因此,本发明另一个实施方案包括敲除了和YAP3IYPS1基因二者的酵母菌株。表述“敲除”意指该基因全部缺失或者如先前所述使其无功能。本发明的方法产生带有完整C-末端的非降解肽。这有高的商业价值,因为生产同质产物将显著减少纯化成本。在再一方面,本发明涉及一种用于制备C-末端酰***化肽的方法,所述方法包括以下步骤a)在用于在酵母菌株中表达多肽的条件下培养具有非功能性於沈7基因和包含编码带有C-末端Gly的多肽的DNA序列的酵母菌株,b)来自步骤a)的表达的多肽的体外a-酰***化,和b)C-末端酰***化肽的分离和纯化。在另一方面,本发明提供一种具有非功能性KEXl基因的酵母细胞培养物,其包含编码带有C-末端Gly残基的多肽的多核苷酸序列,所述多核苷酸序列或DNA序列与编码酵母启动子和前导序列(原序列(prosequence)或前原序列(preprosequence))的多核苷酸序列或DNA序列和/或酵母表达和分泌所述多肽所必要的其它多核苷酸序列或DNA序列有效连接。所述编码多肽的DNA可与用于引入合适宿主的多种其它DNA序列相连。伴随DNA取决于宿主的性质、将DNA引入宿主的方式和是否期望在宿主染色体上维持或整合游离基因。通常,将
DNA在用于表达的合适的取向和正确的阅读框内插入表达载体,例如质粒。然后通过标准技术将载体引入宿主,通常,选择转化的宿主细胞是必要的。在载体中,多核苷酸序列或DNA序列与编码酵母启动子和前导序列(原序列或前原序列)的多核苷酸序列或DNA序列和/或酵母表达和分泌所述多肽所必要的其它多核苷酸序列或DNA序列有效连接。如果期望整合,那么将DNA在用于表达的合适的取向和正确的阅读框(其侧翼为任何非必要酵母基因、转座子序列或核糖体基因的同源序列)内插入酵母整合质粒载体,例如PJJ215、pJJ250、pJJ236、pJJ248、pJJ242(Jones&Prakash,Yeast6:363,1990)或pDP6(Fleig等Gene46:237,1986)。优选地,侧翼序列为酵母蛋白酶基因或用作选择标记的基因。然后通过发生在侧翼序列中的同源重组将DNA整合在宿主染色体上,这通过使用Rothstein(MethodinEnzymoI,194:281-301,1991)和Cregg等(Bio/:905-910,1993)所示的标准技术。然后将被本发明的重组DNA转化的宿主细胞在本领域技术人员考虑到本文公开的教导而知晓的适当条件下培养同样知晓的足够时间,以使能够表达和分泌待根据本发明的方法生产的多肽。有用的酵母质粒载体包括POT(Kjeldsen等Gene170:107-112,1996)和YEp13>YEp24(RoseandBroach,:234-279,
1990)和pG质粒(:289-398,1991)。用于转化酿酒酵母的方法包括原生质球转化、醋酸锂转化和电穿孔,(1991)。优选地,转化如本文实施例中所述。用于酿酒酵母的合适启动子包括MFaI启动子、半乳糖诱导型启动子(例如GALUGAL7和GALlO启动子)、糖酵解酶启动子(包括TPI和PGK启动子)、TRPl启动子、CYCI启动子、CUPl启动子、PH05启动子、ADHl启动子和HSP启动子。在毕赤酵母属中适宜的启动子是AOXI(甲醇利用)启动子。转录终止信号优选真核基因的3’侧翼序列,其包含用于转录终止和聚腺苷酸化的适当信号。适宜的3’侧翼序列可为例如与使用的表达控制序列(即相当于启动子)天然连接的基因的序列。用于提供期望多肽的分泌表达的DNA构建体包括包含通过酵母加工信号与多肽连接的前导序列的DNA序列。前导序列包含用于蛋白质易位穿过内质网的信号肽(“前序列(pre-sequence)”)和任选包含另外的序列(“原序列”),其在多肽被释放到周围培养基中之前在酵母细胞中可或可不被切割。有用的前导序列是小鼠a-淀粉酶信号肽、酿酒酵母MFaI、YAP3、BARI、HSP150和克鲁弗酵母(5kluyveri)MFa信号肽和酿酒酵母1^01、￥々3、?1(、邯?150和克鲁弗酵母1^0的前原序列和在WO92/11378、WO90/10075和TO95/34666中所述的合成前导序列。此外,根据本发明的方法生产的多肽可提供有如