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用于检测人ugt1a1基因多态性的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法
本发明提供用于检测UGT1A1基因*6型与*28型两个位点核苷酸多态性的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法,根据“等位基因特异PCR”原理,在实时荧光定量PCR技术平台上检测亚***四氢叶酸还原酶UGT1A1基因*6型与*28型两个多态性位点的核苷酸类型。
【专利说明】用于检测人UGT1A1基因多态性的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学临床分子检测领域,具体涉及用于UGTlAl基因*6型与*28型两个位点核苷酸多态性检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]尿苷二磷酸葡萄糖醛酰转移酶(UGTs)是一大类能催化葡萄糖醛酸与亲核底物结合的膜结合酶,主要存在于肝脏和肝外组织内质网。UGT分为两个家族,已经发现有17种人类的基因编码不同序列的UGT。酶的表达具有明显的组织特异性,主要在肝脏中表达,其他组织包括脑、肾、胃肠道等。UDP-葡萄糖醛基转移酶IAl(简称UGT1A1),参与多种物质的葡萄糖醛
基化,这一结合反应的目的在于增加底物的水溶性,增加从胆汁和尿液中的排泄量,达到物质代谢、解毒的目的。UGTlAl基因有30多个等位基因,其中一些SNP可影响酶的功能和分步。
[0003]伊利替康是(Irenotecan,CPT-Il)是喜树碱半合成衍生物,在体内经羟酸酯酶水解成7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38),SN-38是DNA拓扑异构酶I的抑制剂,作用于细胞周期S期,抑制、干扰DNA修复和转录。伊利替康自用于临床后,一直是治疗直结肠癌最有效的化疗药物之一。但在临床使用中,也发现伊利替康会导致严重的血液毒性和消化道毒性,表现为腹泻和中性粒细胞减少,发生率可达30%和50%,严重时会导致死亡。
[0004]临床研究研究表明UGT1A1*6型和*28型与伊利替康引发的副反应有着强相关性,且种族差异。在高加索患者中,UGT1A1*28纯和子(TA7/7)和杂合子(TA6/7)显著增加患者发生严重粒细胞减少和腹泻的风险。而在亚洲患者中,UGT1A1*6型突变显著增加患者发生3~4级中性粒细胞减少、血小板减少及腹泻的风险。
[0005]UGT1A1*>A。亚洲人群中,A/G和A/A携带者在伊利替康治疗中,发生3~4级中性粒细胞减少和非血液学毒性的风险显著提高,UGT1A1*6型突变在亚洲人群中的携带比例高达13?23%。UGT1A1*28多态性是指
UGTlAl基因启动子区TA碱基重复序列的多态性,正常野生型为6个TA重复序列(TA6),而*28型则含7个TA重复序列(TA7),根据TA重复序列的多少,可以分为*1/*1、*1/*28和*28/*28。UGT1A1*28纯合突变型在非洲人和高加索人中频率较高达到12?27%和5?15%,在亚洲人中,?5%。
[0006]对UGTlAl多态性基因型进行分析,大多采用PCR-RFLP、DNA直接测序法,荧光PCR法,HRM法和毛细管电泳法。由于PCR-RFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因,往往出现结果误判现象,影响其检测准确率,另外其检测周期长、通量较低,亦不适用于大量人群的快速筛选。另外,作为基因检测金标准的DNA直接测序法,由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点,难以实现大规模推广。其他方法也存在特异性不高,检测周期长等缺点。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术检测UGTlAl基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足,提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的UGTlAl基因多态性检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法,用于检测人UGT1A1*(G/A)多态性和*28型启动子(TA6/7)多态性,本发明快速、成本低,具有广泛推广价值。
[0008]为达到上述目的,本发明采用的技术方案是:一种用于检测人UGTlAl基因多态性的检测引物及其相应探针,(G/A)多态性设计,序列如下所示:反向引物:UGTlAl*6G:5'-GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC-3'();UGTlAl*6A:5'-GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT-3'(SEQIDΝο·2);正向引物:UGTlAl*6F:5'-ACTGTTGATCGCAGTGGATGG-3'(SEQIDΝο·3);荧光探针:TM-UGT1A1*6:5'荧光基团-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT-3'淬灭基团()。
[0009]本发明还提供了一种用于检测UGTlAl基因多态性的检测引物及其相应探针,根据UGTlAl基因*28型(TA6/7)多态性设计,序列如下所示:反向引物:UGTlAl*28TA6:5'-TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA-3'(SEQIDΝο·5);UGTlAl*28TA7:5'-TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA-3'(SEQIDΝο·6);正向引物:UGTlAl*28F:5'-GCTCCACCTTCTTTATCTCTG-3'(SEQIDΝο·7);荧光探针:TM-UGT1A1*28:5'荧光基团-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC-3'淬灭基团()。
[0010]本发明还提供了一种用于检测人UGTlAl基因多态性的内控引物对及相应荧光探针,序列如下所示:内控引物对:
正向引物:GAPDHF:5'-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3'(SEQIDΝο·9);反向引物:GAPDHR:5'-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3'();内控荧光探针:TM-GAPDH:5'荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3'淬灭基团()。
[0011]上述检测人UGT1A1*(G/A)多态性的探针、检测人UGT1A1*28基因多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5'端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团,优选FAM,TET,VIC,HEX或R0X,3'端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团,优选BHQ-1、BHQ-2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA,更优选的方案为检测荧光探针的5'端连有的荧光基团为FAM,3'端连有的淬灭基团为BHQl;内控荧光探针的5'端连有的荧光基团为Hex,3'端连有的淬灭基团为BHQl。
[0012]本发明还提供了一种用于检测人UGTlAl基因多态性的荧光PCR试剂盒,(G/A)多态性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说,(G/A)多态性的两种特异性反应液:UGT1A1*6GPCR反应液与UGTlAl*6APCR反应液,和/或检测人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的两种特异性反应液:
UGT1A1*28TA6PCR反应液与UGTlAl*28TA7PCR反应液;其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外,还对应的包含上述检测引物与探针。上述各特异性检测的PCR反应液分别包含的引物与探针的序列如下:(1)UGTlAl*6GPCR反应液UGTlAl祁G:5'-GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC-3';UGTlAl*6F:5'-ACTGTTGATCGCAGTGGATGG-3'TM-UGT1A1*6:5'荧光基团-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT-3'淬灭基团(2)UGTlAl*6APCR反应液UGTlAl祁A:5'-GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT-3';UGTlAl*6F:5'-ACTGTTGATCGCAGTGGATGG-3'TM-UGT1A1*6:5'荧光基团-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT-3'淬灭基团(3)UGTlAl*28TA6PCR反应液UGTlAl*28TA6:5'-TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA-3';UGTlAl*28F:5'-GCTCCACCTTCTTTATCTCTG-3'TM-UGT1A1*28:5'荧光基团-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC-3'淬灭基团(4)UGTlAl*28TA7PCR反应液UGTlAl*28TA7:5'-TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA-3';UGTlAl*28F:5'-GCTCCACCTTCTTTATCTCTG-3'TM-UGT1A1*28:5'荧光基团-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC-3'淬灭基团上述试剂盒的PCR反应液优选方案中,(C/T)多态性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针外,还包括
一对内控引物及相应荧光探针,内控引物和探针的序列如下:内控引物:GAPDHF:5,-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3'GAPDHR:5'-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3'内控荧光探针:TM-GAPDH:5'荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3'淬灭基团。
[0013](G/A)多态性的探针、检测人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5'端的荧光基团可以为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团,优选FAM,TET,VIC,HEX或R0X,3'端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团,优选BHQ-UBHQ-2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA,更优选的方案为检测荧光探针的5'端连有的荧光基团为FAM,3'端连有的淬灭基团为BHQl;内控荧光探针的5'端连有的荧光基团为HEX,3'端连有的淬灭基团为BHQl。
[0014]上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述,优选的PCR扩增条件为:预变性的条件为:温度为95°C,时间为3分钟;PCR反应由第一阶段和第二阶段构成:第一阶段由10次扩增循环构成,其条件为:变性:温度为95°C,时间为30秒;退火:起始温度为58°C,时间为30秒;延伸:温度为62°C,时间为30秒;第二阶段由
30次扩增循环构成,其条件为:变性:温度为95°C,时间为30秒;退火:温度为58°C,时间为30秒;(设置荧光信号采集)延伸:温度为62°C,时间为45秒。
[0015]本发明还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的检测UGTlAl基因多态性的荧光PCR试剂盒进行UGTlAl基因多态性检测的方法,步骤包括:(1);,推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA;,要求浓度大于lOng/μΙ;0D260nm/0D280nm=?。
[0016](2)荧光PCR扩增:(G/A)多态性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针PCR反应液内,在荧光PCR管内混合均匀离心后,放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应,优选将待检测模板DNA与一定量的TaqDNA聚合酶加入含有内控引物及相应荧光探针的上述试剂盒优选方案的PCR反应液内,在荧光PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应,用以监测反应有效性。
[0017]上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行
PCR反应:预变性的条件为:温度为95°C,时间为3分钟;PCR反应由第一阶段和第二阶段构成:第一阶段由10次扩增循环构成,其条件为:变性:温度为95°C,时间为30秒;退火:起始温度为58°C,时间为30秒;延伸:温度为62°C,时间为30秒;第二阶段由30次扩增循环构成,其条件为:变性:温度为95°C,时间为30秒;退火:温度为58°C,时间为30秒;(设置荧光信号采集)延伸:温度为62°C,时间为30秒。
[0018](3)分析结果在上述UGT1A1*,观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增"S"型曲线,则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。
[0019]在上述UGT1A1*28型TA6和TA7PCR反应体系与温度循环程序条件下,观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增"S"型曲线,并且目的检测荧光信号的Ct值与内参荧光信号的Ct值得差值小于预设值4,则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。
[0020](G/A)多态性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针在检测人
UGTlAl基因多态性中的应用。
[0021](G/A)多态性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针的试剂盒在检测人UGTlAl基因多态性中的应用。
[0022]本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。
[0023]:等位基因特异PCR(AlleleSpecificPCR,ASPCR),又称为等位基因特异性扩增法(AlleleSpecificAmplification,ASA)或者扩增受阻突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystemARMS-PCR),其基本原理是由于TaqDNA聚合酶缺少3'一5'外切酶活性,在进行PCR反应时,若引物3'端形成错配,链延伸反应就会因为3',5'-磷酸二酯键形成的障碍而受阻,导致PCR产物量急剧减少,在一定扩增循环内,不会检测出特异的扩增产物;反之,3'端配对则能够检测出扩增产物。于是,针对已知的多态性位点,将其多态性碱基设计于检测引物的3'端,扩增反应后,通过凝胶电泳观察产物的有无即可判断多态性位点的碱基类型。
[0024]突光定量PCR是(Real-timePCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量实验技术,在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针被称"TaqMan探",为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭