生物反应器的制作方法 5.docx

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专利名称:生物反应器的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种生物反应器。
本发明具体涉及一种使用固定化活生物材料的生物反应器。
本发明更具体涉及一种包括硅质层的生物反应器,所述硅质层在存在或未存在支架材料和基质的情况下能固定上述活生物材料。
已知可通过在基质表面上沉积的硅质层固定或截留生物材料,其中基质容纳有下文称为“生物质”的诸如酶,细菌,酵母,植物或动物细胞的上述生物材料。
上述硅质层应具有以下特征a)固定上述生物质以防止生物质从基质释放进入生物反应器的液体培养基中。
b)保持生物质的活性,使得在固定相与培养基之间进行可控和确定的输送,和c)是生物相容的,这样活体动物的体器官或体液就可与固定化生物质接触。
已知可通过溶胶-凝胶法固定生物质,该方法在溶液中进行,从液相中的金属或烷氧化硅开始。
然而,该方法具有多个缺点,例如a)在许多生物系统中产生有毒的醇,b)所需pH也许不适合于活细胞或可加快某些生物活性酶变性,
c)所需搅拌操作对于对流体-机械应力敏感的细胞系可能是有害的,
d)某些实验步骤与所需的无菌环境不相容,和e)该方法不适用于那些需确定的结构组织以避免功能丧失的生物质。
为克服上述缺点,人们建议通过使用载有烷氧化硅气体介质的方法将截留的生物质固定在基质内。
具体来说,US5998162描述了通过与气态烷氧化硅反应将植物细胞固定在在细胞表面上获得的硅质层内。上述固定化细胞在六个月后没有从溶液中逃逸且保持其存活率,并产生了次生代谢物。可将上述固定化细胞用于制药应用。
WO97/45537描述了通过与气态烷氧化硅反应由直接沉积在细胞表面上的硅质层将动物细胞截留。该方法无毒且存活细胞未经介质淋洗,同时不会由于介质侵入而繁殖。可将截留细胞用于生物人造器官及所需产品。
然而,在某些情况下,人们已观察到将硅质层直接沉积在细胞表面上降低了效果和功能并污染活体动物的体器官和/或体液以及使活生物质的活力消失。
因此,本发明的发明人研究了上述现象并发现在某些情况下发挥效果和功能需要凝胶基质中的生物质成分之间自由接触,同时上述污染是由于源自生物质的病原物质,而生物质活力的消失是由于宿主生物体的体液的抗体所致。
确实,生物体的抗体能识别生物质的异种动物细胞表面上的表位,从而将其破坏。
因此,本发明要解决的主要问题是提供一种能防止上述不便的生物质固定系统。
通过如本发明所附的权利要求书中列举的生物反应器及其制备方法解决了上述问题。
本发明的发明人通过进一步研究指出,一方面,抗体和病原物质具有大于150,000Da的分子量,同时另一方面,现有技术的硅质层所具有的孔隙不能够完全保留或排除上述分子。
因此本发明的首要目的在于提供一种能够固定生物质并选择性阻断分子量大于所选阈值的大分子的硅质层的制备方法,该方法包括以下步骤a)提供被选自(1)Si(OR)4,(2)SiH(OR)3,(3)R′Si(0R)3和(4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅混合物饱和的载气气流,其中R和R′相同或不同,分别为烷基和/或芳基,其中所述气流通过使载气在20至180℃的温度下鼓泡通过混合比为(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60(%v/v),优选混合比为(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4)0-50(%v/v),更优选混合比为(1)50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4)5-30(%v/v)的上述烷氧化物的液体混合物制备,和b)将含生物质的支持体在步骤a)的气流中暴露预定时间,其中,选择所述分子量阈值在10000道尔顿和150000道尔顿之间,在步骤a)中选择(1),(2),(3)和(4)硅衍生物的混合比作为待阻断大分子分子量的函数。
考虑到生物反应器的预定特殊应用,可根据不同情况选择待阻断大分子的分子量。
例如,阻断分子量大于150,000道尔顿的大分子使得可排除源自宿主生物体体液的抗体和源自生物质的病原体通过硅孔。这样就防止体液与生物质的相互伤害。70,000道尔顿的阻断阈值也阻止了诸如C1s(90kD),C1qINH(80kD),C3bINA(80kD),C9(80kD)和C3PA(80kD)的补体系统成分通过硅膜,从而防止发生补体的非抗体触发活性。另一方面,70kD的阻断阈值足够大,使得大分子量物质从生物质扩散至体液。上述物质可以是诸如胶原蛋白,粘多糖或纤连蛋白的胞外基质分子,它们对于移植应用中的生物相容性是必不可少的。相反,90kD的阻断阈值在阻止补体系统成分方面选择性小,但允许更大量的物质进行交换。
通常,可将具有130kD至150kD阻断阈值的硅质膜用于工业规模的生物反应器,其中必须最大限度的提高由生物质产生的高分子量分子分泌并扩散到培养基中。相反,当生物质产生低分子量分子并将低分子量分子从培养基中分离时也可以在工业型生物反应器中再次使用10kD阻断阈值。
本发明的硅质层阻断具有所选分子量阈值的大分子的能力取决于下述步骤a)中硅衍生物的混合物组分,将描述如下。
作为一般指导,硅衍生物中烷氧基的存在有助于交联的形成,从而使所形成的硅膜中孔的尺寸减少。在混合物中引入相对于每个硅原子具有较少烷氧基的相对少量的硅衍生物
(例如R′Si(OR)3或R′SiH(OR)2)会增大膜孔。
具体来说,Si(OR)4和R′SiH(OR)2混合比为75∶25至80∶20的二元混合物(A)会形成具有约90kD阻断值的硅膜。通过向上述混合物中加入最高为约10%v/v的R′Si(OR)3替换相同量的Si(OR)4于是可得到Si(OR)4/R′SiH(OR)2)/R′Si(OR)3为65-78%/20-25%/1-10%的混合物(B),将得到阻断值最高为150kD的硅膜。
当向上述硅衍生物的混合物中进一步加入最高含量为约20%v/v的R′Si(OR)3并替换相同量的Si(OR)4时,膜的阻断阈值逐渐降低至10kD。该结构对应于Si(OR)4/R′SiH(OR)2)/R′Si(OR)3的混合比为53-70%/20-25%/10-22%的混合物(C)。不受任何理论的限制,上述效果可能是由于疏水性增加和由于更大量的烷基(R′基团)所产生的阻碍,从而阻塞孔隙。
由上述讨论清楚可知,通过例如上述具有合适组成的三元混合物(B)或三元混合物(C)(R′Si(OR)3含量不超过10%v/v)反应可得到介于90kD和150kD之间的相同阻断阈值。另外,通过二元混合物(A)也可以得到约90kD的阻断值,而通过诸如R′Si(OR)3组分含量超过10%v/v的混合物(C)反应可得到介于10kD和90kD之间的阻断阈值。
优选R为乙基或***,R′为***。
通常,步骤a)的载气是空气。
优选对应于每平方厘米暴露表面为1至100mL的总气体,步骤a)。
优选步骤a)的饱和温度为20至100℃。
通常,步骤b)的支持体为粘附于支架材料的基质。
在本发明的另一实施方案中,步骤b)的支持体为粘附于支架材料的微球形基质。。
在本发明的另一实施方案中,步骤b)的支持体为无支架材料的,。
在本发明的另一实施方案中,步骤a)是在承载于支架材料而无基质的生物质上进行的。
基质的典型实例为胶原蛋白凝胶,琼脂,右旋糖苷,胨,海藻酸盐,角叉藻聚糖和胶体。上述基质可进一步含有诸如钡盐的不透射线材料和/或诸如磁性颗粒及NMR位移试剂的NMR成像检测促进剂。
支架材料的典型实例是多孔纸张,玻璃纤维,织物,纺织纤维,多孔陶瓷,玻璃体,天然海绵和泡沫有机聚合物。特别优选的支架材料是天然海绵。
,。
优选本发明硅质层的临界剪切稀化应力高于10Pa,更优选为12至20Pa。
因此,本发明的目的在于提供一种含硅质层的生物反应器,所述硅质层能够固定生物质并选择性阻断分子量高于所选阈值的高分子,通过以混合比为
(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60(%v/v),优选(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4)0-50(%v/v),更优选(1)50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4)5-30(%v/v)混合选自(1)Si(OR)4,(2)SiH(OR)3,(3)R′Si(OR)3和(4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅可获得上述硅质层,其中R和R′相同或不同,分别为烷基和/或芳基。
本发明的特殊方面是在该生物反应器中使用固定化酶。在该情况下,所述硅质层必须防止所述酶释放进入液体培养基中。通常,许多生物相关酶具有大于10,000Da的分子量。
因此,本发明提供了一种制备硅质层的方法,所述硅质层能够固定生物质,并选择性阻断分子量高于所选阈值的大分子,其中所述阈值选自10,000Da至150000Da,该方法包括以下步骤a)提供被选自(1)Si(OR)4,(2)SiH(OR)3,(3)R′Si(OR)3和(4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅混合物饱和的载气气流,其中R和R′相同或不同,分别为烷基和/或芳基,其中通过使载气在20至180℃的温度下鼓泡通过混合比为(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60(%v/v),优选(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4)0-50(%v/v),更优选1)50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4)5-30(%v/v)的上述烷氧化物的液体混合物制备所述气流,和b)将含有生物质的载体暴露在步骤a)的气流中。
术语“生物质”指的是能够执行生物类型功能的动物或植物源生物材料。
“生物类型功能”的典型例子包括生产用于治疗疾病的产品,生产诸如酶,生长因子,细胞因子和激素的次生代谢物和蛋白质。
上述生物质的例子包括动物和植物细胞,或初级细胞系,干细胞系和突变细胞系,其聚集体,酶和微生物,所有上述生物材料可以未经过或经过基因工程修饰。
能够生产适于治疗疾病的产品的生物质的例子包括用于治疗慢性疼痛,用阿黑皮素原基因转染能够产生β-内啡肽的Neuro2A细胞系(如Saiton,,4Suppl1S13-7所述);用于治疗帕金森症,能够产生多巴***的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞(ATCCCRL-1720);用于治疗阿尔茨海默氏症,能够产生神经生长因子(NGF)的下颌下腺SCA-9clone15(ATCCCRL-1734);用于治疗肿瘤,能够产生IL-2的人淋巴瘤H33HJ-JA1(ATCCCRL-8163);用于治疗垂体侏儒症,能够产生生长激素的垂体GH3细胞(ATCCCCL-);用于治疗血友病,能够产生因子VIII的猪的初级肝细胞;用于治疗哈格曼病症,能够产生因子XII的猪的初级肝细胞;用于治疗贫血症,能够产生红细胞生成素的猪初级肾细胞或Hep-G2细胞(-7976,1988中所述);用于治疗
I型胰岛素依赖性糖尿病,能够产生胰岛素的猪的胰岛;在体外人造肝脏中所使用的猪初级肝细胞。
术语“生物反应器”既是指本发明
图1所述类型的设备,也是指通过本发明的硅质层将生物质固定在基质上形成的生物单元。
因此,当本发明的生物反应器为生物单元时,它也可以是细胞尺寸的。
本发明的发明人进一步研究发现,当本发明的生物反应器的支持体为含生物质而不含支架材料的微球形基质时,可将所述生物反应器直接注射到病人的器官中。
可直接注射本发明生物反应器的器官的典型例子包括脊髓背根,脑髓,基底神经节,梅纳德氏(Meynert)基底核,外科手术摘除肿瘤的病灶,门静脉,腹膜以及肝脏。
因此,本发明的另一目的是使用由上述方法得到的生物反应器制备可注射的药物组合物以执行其生物类型功能。
通常,可将本发明生物的反应器用作人造器官以整合或代替受损器官。
用以整合或代替受损人体器官的生物质的例子包括用于受损胰腺例如胰岛的胰细胞;用于受损肝脏的猪肝细胞;用于受损甲状腺,甲状旁腺和肾上腺的源自甲状腺,甲状旁腺,脑皮层和髓状肾上腺的细胞。
本发明的可注射药物组合物包括悬浮在常规生理溶液中的有效量的微球形生物反应器。
本发明的可注射药物组合物中微球形生物反应器的含量可在相当宽的范围内变化,这取决于许多已知因素,例如待治疗疾病类型,疾病的严重程度,病人体重,日服药剂型的次数和所选生物质的效力。
然而,本领域技术人员能够容易地按常规确定其最佳量。
通常,本发明的可注射药物组合物中微球形生物反应器的含量为100-。
例如,当本发明的微球形生物反应器中含有胰岛作为生物质时,可注射药物组合物中微球的含量为每千克体重含2000至25000个委微球,优选每千克体重含10000个微球,其中每个微球含一个或多个胰岛。
可根据本领域技术人员的已知技术制备本发明的可注射药物组合物,其步骤包括混合,溶解和消毒。
另外,通过以下非限制性实施例中优选实施方案的描述,本发明的特征和优点变得更加清晰。对于附图,其中图1是本发明生物反应器(10)的示意性剖面图。
图1A是与图1的生物反应器(10)的入口区域19″相连的可拆除气体供给设备19的示意性剖面图。
图2是承载在聚氨酯泡沫体上并用实施例2的硅质层涂覆的芸香(Rutagraveolens)细胞的显微照片。
图3是与从实施例3a的非固定化细胞所得蛋白质相比,由硅质层固定的