文档介绍：蛋白酶产生菌的分离
通过本实验项目,使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法,菌种的纯化技术、高产菌的选育技术;了解蛋白酶产生菌的生长情况,学会绘制其生长曲线;学会培养基优化的方法;了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理;掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。 1 实验材料
实验样品
校园内土壤样品
牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水(带玻璃珠)、芽孢染色液番红;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、,玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸( pH —)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计(应符合GB9721的规定)等。 2实验方法与步骤 培养基的配制方法
按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。
按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎,用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
(15磅/英寸2),℃, 15-20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存。
将灭菌后的培养基冷凝至55~60℃,放在超净台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶瓶底,左手拔下棉塞,将瓶口在酒精灯上稍加灼烧,左手打开培养皿盖,右手迅速将培养基倒入培养皿中,以铺满皿底为度。
待培养基凝固后,5个培养皿一叠,倒置平放在恒温培养箱中培养24—48
小时,以检查灭菌是否彻底。
1)采集土壤样品,用无菌水制备1:10土壤悬液;
2)取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中,将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min,以杀死非芽孢细菌;
3)取加热处理过的土壤悬液100-200 μL,涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板,将平板倒置,于
30-32 ℃培养24-48 h;
4)对长出的单菌落进行编号,选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落,挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色,判断是否为芽孢杆菌。
蛋白酶产生菌的筛选
1)从判定为芽孢杆菌的菌落处,分别挑取少许菌苔,先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板,30-32 ℃培养24-48 h,测定平板上菌苔直径和水解圈直径。
2)水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物,可作为进
行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
紫外线对出发菌株的诱变效应
1)菌悬液的制备:①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支,用10 ml 无菌生理盐水将菌苔洗下,倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中,振荡30分钟,以打碎菌块。②将上述菌液离心(3000 r/min,离心15分钟),弃去上清液,将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次,最后制成菌悬液。③用显微镜直接计数法计数,调整细胞浓度为每毫升1