文档介绍：血清蛋白的分离——聚丙烯酰***凝胶电泳法
【摘要】目的 1.、学****聚丙烯酰***凝胶电泳原理。2、掌握聚丙烯酰***园盘电泳的操作技术。3、比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。方法采用聚丙烯酰***凝胶电泳法对血清蛋白进行电泳分离,最后与醋酸纤维薄膜电泳的条带进行比较。结果聚丙稀酰***凝胶电泳法电泳鸡血清蛋白,在凝胶染色后出现了5条染色带。结论聚丙烯酰***凝胶电泳法分离血清蛋白的效果要比醋酸纤维薄膜电泳好得多。【关键词】聚丙烯酰***凝胶电泳法、电泳、血清蛋白
近年来我国家禽发生禽流感病状很严重,为了更好的预防和治疗禽流感,我们决定先采用聚丙烯酰***凝胶电泳法初步的鉴定鸡血清中含有几种蛋白质,因为大多数病毒都是依赖蛋白质为原料进行复制增多的。然后再用考马斯亮蓝R250对电泳出来的凝胶进行染色、鉴定。同时,也为了比较聚丙酰***凝胶电泳法与醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的效果。
对象与方法
一、对象
1、检测标本:选取一只健康的鸡,杀鸡取血置于一个大烧杯内,用分离法分离血清。
2鸡血清的提取:采用高速离心机对原血进行高速离心,上清液就是鸡血清。
二、方法 1、原理
(1)盘状电泳是在区带电泳原理的基础上,以孔径大小不同的聚丙烯酰***凝胶作为支持物,采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性),使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带(厚度为10-2厘米),然后再进行电泳分离。
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盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性(discontinuity),凑巧分离出的区带也很象圆盘状(discoid shape),取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。因此,英文名称为disc electrophoresis,中文直译为盘状电泳。
仪器装置:上下两个槽为圆形或方形,其中注入缓冲液。上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。上槽底部有很多小孔,可插入装有聚丙烯酰***凝胶的玻璃管。
这里仅以Davis和Orstein(1964)用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便说明其基本原理。此系统是一个高pH的碱性系统,或称阴离子系统,最初用于分析血清蛋白,但也适用于其他的酸性和中性蛋白。很多细胞蛋白质,或病毒的结构蛋白在此系统中(pH8—9)解离成阴离子,向阳极移动。系统由下列三种不连续的凝胶组成。即在每支玻璃管中装有三层不同的凝胶。最上层为样品胶,中层为浓缩胶(又称间隔胶或积层胶),下层为分离胶(又称电泳胶)。
在盘状电泳过程中有三种物理效应:①样品的浓缩效应,②凝胶的分子筛效应,③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好,分辨率高。例如人血清用纸
电泳()可以分成5—7个成分,而用盘状电泳也可分成20—30个条带清晰的成分。若采用不连续的浓度梯度凝胶柱,则可增至62个条带。又如人的唾液经盘状电泳。可分出10多个蛋白质条带。
(2)聚丙烯酰***凝胶电泳是以聚丙烯酰***凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰***(Acr)和交联剂N,N—甲叉双丙烯聚酰***(Bis)聚合而成。聚丙烯酰***凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的,但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基