文档介绍：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
电泳是指带电粒子在电场的作用下,发生定向泳动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。
电泳基本原理:
COO- COO- COOH
╱+ H+ ╱+ H+ ╱
Pr ←————→ Pr ←————→ Pr
╲+ OH- ╲+ OH- ╲
NH2 NH3+ NH3+
PH>PI PH=PI PH<PI
蛋白质N端游离氨基,C端游离羧基以及侧链上一些基团在一定pH条件带电荷, 因此可以用电泳技术分离和鉴定。
电场力 F=XQ (X:电场强度, Q:电荷量)
阻力 F=6πγηυ(γ:半径,η:介质粘度)
当电泳颗粒匀速运动:
F= F
QX=6πηγν
ν/X=Q/6πηγ
带电粒子的迁移率
ν/X 用U表示,称迁移率(mobility)
即单位电场强度时粒子运动的速度,取决于带电粒子的电荷量Q 、粒子大小γ和形状。
Q越多,V越大;r越小,V越大;球形分子>纤维状
影响电泳速度的因素:
样品本身:带电量,分子大小,形状
电场强度:电压
电泳介质的pH和离子强度
电渗作用
按凝胶装置分为盘状电泳及板状电泳
盘状电泳通常是不连续系统,利用缓冲液离子成分、pH、凝胶孔径进行电泳,带电颗粒电泳时具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分类
以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是单体聚丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的,催化剂为过硫酸铵(AP),加速剂为四甲基乙二胺TEMED, 形成三维网状凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)的聚合反应:
缓冲液离子成分、PH的不连续性: Tris-甘氨酸缓冲液, Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=,甘氨酸的电离小,有效迁移率小,称为慢离子;浓缩胶中的氯离子完全电离,有效迁移率大,称为快离子;蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后,氯离子跑得最快,留下一段低电导区,产生高电位梯度(电位与电导率成反比),使甘氨酸离子追赶氯离子,蛋白质夹在中间而被压缩。。
三大效应:浓缩效应
成分
pH值
孔径
电泳缓冲液
甘氨酸(慢离子)
样品
蛋白质
浓缩胶
Cl-(快离子)
大
分离胶
Cl-(快离子)
小
有效迁移率= 迁移率解离度