文档介绍：专业: 农业资源与环境
姓名: 李佳怡
学号: 3130100246
日期:
地点: 生物实验中心310
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实验报告
课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年成绩:__________________
实验名称: 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛
一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填)
三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填)
五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理
七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得
一、实验目的和要求
1、学****离子交换层析的基本原理;
2、学****离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术;
3、学****蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验内容和原理
(1)实验原理
1、离子交换层析:
以离子交换剂为固定相,液体为流动相进行。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中,不同的蛋白质所带的电荷存在差异,因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时,使某一种蛋白质的电荷被中和,与离子交换剂的亲和力降低,不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来,达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成。
基质
电荷基团
反离子
电荷基团
反离子
电荷基团
反离子
基质
基质
—
+
—
+
+
可逆交换
可逆交换
+
+
溶液中的离子
或离子化合物
(交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖)
—
—
—
阳离子交换剂
阴离子交换剂
由于蔗糖酶的pI偏酸性, 缓冲液的环境中,粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷,因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。
酶活力检测(定性检测)
蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC ),能催化非还原性双糖(蔗糖)裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。
-二硝基水杨酸法,-二硝基水杨酸与还原糖共热(100℃)被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比,由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。
实验内容
1、离子层析分离纯化实验1中粗分离纯化的蔗糖酶样品Ⅲ;
2、定性检测判断所提取的蔗糖酶纯化样品多少。
三、实验材料与试剂
1、实验材料
蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ
2、实验试剂
① DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂);
②20mmol/L Tris-HCl 缓冲液;
③20mmol/L Tris-HCl,(1mol/L NaCl) ;
④, ;
⑤5%蔗糖溶液;
⑥3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)。
附:3,5-二硝基水杨酸试剂配置方法
甲液: 10%NaOH溶液中,并用水稀释至69ml,;乙液:称取255克酒石酸钾钠加到300m