文档介绍：NBT法测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)活力植物组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定
Planta, 2002, 215: 1022
背景知识
植物在逆境胁迫或衰老过程中发生一系列生理生化变化: 如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调、活性氧的积累等。
生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O2.-)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O21)等。
活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。
植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统:
酶促防御系统: SOD、CAT、POD和APX等
非酶促抗氧化剂: ASA和GSH等
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一,它的产生还能加剧膜的损伤。因此,丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度,也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中,丙二醛含量是一个常用指标。
背景知识
实验目的
实验原理
实验材料与设备
实验步骤
注意事项
结果比较分析
思考题
NBT法测定SOD活力
实验目的
了解胁迫反应的具体机制(膜脂过氧化& 抗氧化)
了解抗氧化防护酶的测定方法,掌握NBT法测定SOD活力
实验原理
SOD催化下列反应:
2O2.-+2H+→H2O2+O2
本实验依据SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。
光 SOD H2O2
核黄素+甲硫氨酸 O2.- + NBT →甲腙(560nm)
光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。 SOD酶量与光化还原抑制百分率在一定范围内呈线型关系,一般以引起50%光化还原抑制率的酶量为一个酶活力单位
材料、仪器设备及试剂植物生理生化实验 p172-173
(一)材料:小麦叶片
(二)仪器设备:;;
样器;;。
(三)试剂: mol/L 磷酸缓冲液PBS()
195 mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液
mmol/L 氮蓝四唑NBT溶液
100 umol/L EDTA溶液
60 umol/L 核黄素溶液
实验步骤
1. 酶液提取:取1 g材料于预冷的研钵中,加5 ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,15 000 g(4℃) 离心15 min,上清液即为SOD粗酶液。
2. 显色反应:取5ml试管4支,2支为测定管,另2支为对照管。
反应体系中各试剂的终浓度为130 mmol/L Met,75 μmol/L NBT, 4 μmol/L 核黄素, 100 nmol/L EDTA,按下列次序及量(ml)加入各溶液:
1 2 3 4
磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓冲液
核黄素核黄素核黄素核黄素
Met溶液 Met溶液 Met溶液 Met溶液
EDTA液 EDTA液 EDTA液 EDTA液
酶液酶液缓冲液缓冲液
NBT溶液 NBT溶液 NBT溶液 NBT溶液
3. 测定混匀后将2支试管(不加酶液而用缓冲液,为最大还原管)设为对照,其中1支对照管置于暗处,其它3支置4000Lux光C2023(或阳光)下反应20min(显蓝色),反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定2支试管的OD560
SOD活性计算
SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。
(Ack-AE)×V
Ack××W×Vt
Ack照光对照管的吸光度
AE样品管的吸光度
V样品液总体积(ml)
Vt测定时样品用量(ml)
W样鲜重(g)
SOD总活性(U/g)=