文档介绍：组织和细胞培养
郎朗
第九章细胞遗传学性状检测
一、性染色质检测
女性的两个X染色体中的一个,间期染色质呈异固缩,呈
深染的小体称Barr氏体。Barr氏体位于间期细胞核内
面,呈三角形或半月形小体,易为碳酸复红或硫堇等染
料着色,正常女性Barr氏体阳性,男性为阴性,男性Y染
色质位于间期细胞核近中央部,易为盐酸阿的平着色,
荧光显微镜下观察发较强荧光,呈点状小体,发光部分
系Y染色体异固缩的长臂,初代培养细胞和二倍体细胞
株均可观察到性染色质,传代细胞系表现不规律。
碳酸复红显示X染色质法: 染色液:干液:碱性复红3g,溶100ml70%乙醇中,可保存 工作液:(现用现配)干液10ml;5%石碳酸水溶液90ml;冰醋酸10ml;甲醛(40%)10ml 染色步骤:(1)细胞:BSS洗,染色5-10min,如用涂片应待片干后,迅速投入96%酒精固定10-15min再染色; (2)分化:96%酒精分化1min,分化时要不断摇动; (3)脱水:通过纯酒精1分钟; (4)封片:二甲苯透明2-3min,树胶封固。 结果:细胞质不着色,细胞核染成紫红色,阳性Barr氏体附于细胞核膜内面呈三角形或半月形小体。
荧光染色显示Y染色质法: 荧光染液:PBS100ml; 染色:Y染色质显示染色与染色体荧光显带法相同。 结果:在荧光显微镜下观察,Y染色质呈特别明亮黄绿色荧光圆点,-,可位于核内任何位置,但以近中央时居多。
二、培养细胞染色体显示法 显示染色体主要显示分裂中期细胞,因细胞分裂处于中期时,染色体长短和大小恰到好处,是研究染色体的最好阶段。所以,第一需要获得多量的中期分裂相;第二,人类染色体有46条,密集在细胞中,相互交错缠绕,必须把它们分散开,才便于观察。 : 刺激细胞增殖:分P和M两型,M型作用较强,PHA特别适用于外周血淋巴细胞培养,有强烈的刺激T淋巴细胞增殖的作用,用量每10ml培养液加PHA 。
阻抑中期分裂: 秋水仙素法:秋水仙素有特异抑制纺锤丝蛋白合成作用,能阻抑分裂中期活动,而对DNA作用较小,借此可截获很多中期分裂相,产生类似提高分裂指数的效应。该药有强烈的毒性,用量过大或作用时间过长,可使染色体缩短和发生异常分裂现象。 低温处理:把指数生长期细胞放置到室温或冰箱中4℃4-12h,因温度降低时DNA合成受抑制,细胞不进入分裂期,当恢复用37℃温箱培养并用秋水仙素后,会出现代偿性分裂高潮,也产生提高分裂相数效应。
: 低渗处理:应用低渗盐溶液处理,可使细胞体积胀大、染色体松散,便于制备染色体标本。低渗可用蒸馏水、1%枸椽酸钠、加水稀释培养液(1:3), KC1等方法。,在37℃水浴中作用20-40min,效果最好。 醋酸固定:大多数固定剂都使组织细胞收缩,而醋酸却有膨胀固定作用,和醇类混合固定有利于染色体松散效应。现多应用醋酸/甲醇混合液固定,用时宜现用现配。
培养细胞:指数生长期,80%-90%汇合单层细胞; 加秋水仙素:-µg/ml营养液;温箱继续培养6-10h;或用低温封闭法:把培养细胞置于4℃条件下6-12h,再于37℃温箱中继续培养6-10h; 采集分裂细胞:可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,令培养液在培养细胞表面反复冲涮,应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落; 离心:收集培养液,1000转/分钟离心5-10min; 低渗处理:吸除上清液,加入预温至37℃ KCl溶液,在温箱中静置20-30min;
预固定:向悬液中加新鲜醋酸/甲醇固定液1ml; 固定:离心,去上清,加固定剂5-10ml;置15-20 min;重复一次, 去上清,-1ml; 制片:洗净载物片,预冷, 向片的一侧滴2-3滴细胞悬液,滴片时的距离能保持半米高度。滴片后置室温中令其自然干燥,或用吹风机热风吹干亦可; 染色和封片:一般常用Giemsa染色; 染色1O分钟后,水洗、晾干、可直接观察(适用油浸镜);如标本需 要保存或做长时间观察,可过二甲苯两次后,用中性树胶封片(或先迅速过丙酮两次,每次30秒)后,再过二甲笨,然后封片亦可。