文档介绍：大肠杆菌电转化感受态细胞制备
第一天:
1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养
2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用
3. 准备几瓶灭菌水(),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用
第二天:
4. -1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板摇瓶中
5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时
6. (培养1小时后每半小时测定一次)
7. -,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)
8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)
9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液
11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞
12. 离心,弃上清液
13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)
15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml
16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存
转化方法:
1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟
2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟
3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中
4. 加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT
5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 千伏)(检查时间常数,应该在3以上)
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中
7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原
8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养
 
电转化感受态细胞的制备
   
2005-11-16 23:15:25
大中小
[方法]电转化流程
电转化流程
1.      用枪头挑取单克隆菌落,投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)
2.      37℃,220rpm,培养14-16个小时。
3      第二天,以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次OD,-,停止培养。
4.      将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中,4℃,2500rpm离心10分钟。
5.      弃上清,离心杯中加入少量ddH2O,使沉淀悬浮后,再将水注满离心杯,4℃,4000rpm离心10分钟。
6.      弃上清,加少量灭菌水,重悬菌体,再将水注满离心杯,4000rpm,4℃,离心10min。
7.      弃上清,往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油,  4℃,