文档介绍：第八章 PCR技术及应用 第一节 PCR技术概述 PCR: 聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction),是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用,通过变性-复性-延伸的循环操作,在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 1985年,美国Cetus公司和加利福尼亚大学联合创建的一种DNA的体外扩增技术,用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。 1989年Science 评选的十大科技进展之首,并于1993年获得诺贝尔奖。
PCR技术发展历史: 1. 用大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段的缺点:酶易失活;效率低;易产生非特异性产物。而耐热DNA聚合酶的特点:在95oC稳定,好处:防止二级结构形成或引物非特异退火,延伸性能好。
2 . 手动、机械臂、热循环仪。
3. 加矿物油防止挥发、热盖技术。
4. 冷启动、热启动。
5. 单酶、酶混合物。
一、PCR基本原理
PCR反应时,一般采用变性-复性-延伸三步循环。
:通常采用加热变性,即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到950C,使双螺旋DNA解开成为单链。
:通过降低反应温度至550C,使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3`端粘合,以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH。
:将反应温度提高到约700C,在耐热DNA聚合酶的催化下,根据模板DNA提供的碱基顺序,合成两条互补链,从而使模板DNA扩增一倍。
二、PCR技术特点
1、高度的敏感性
PCR产物的生成是以指数方式增加的,所以欲扩增pg量级的起始物到μg水平或放大真核细胞单拷贝基因,通过PCR方法都是不难完成的。PCR方法可用单、双倍体细胞、一根头发、甚至单一精子进行DNA鉴定。
2、高度的特异性
作为引物的寡核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键。Taq DNA聚合酶耐高温的性质使反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的目的片段也能保持很高的正确程度。
3、操作简便快速:
目前PCR技术采用耐高温的DNA聚合酶(如Taq酶) ,并且在有电脑控制的DNA扩增仪中进行,使操作大为简化,一次加入的酶即可满足反应全过程。DNA扩增仪能自动迅速升降温度,只需把反应所需的全部材料混匀,置入仪器内,反应便依所输入的程序进行。应用TaqDNA聚合酶时,单核苷酸掺入速率较高,75~80℃时,每个酶分子每秒钟可完成150个核苷酸的合成。PCR每一周期需数分钟,所以,一般常取用20~30个周期能使目的DNA达数到百万倍扩增的反应只要2-3个小时即可完成。
4、样品适用广泛:
PCR技术对样品的要求并不十分严格,扩增样品可以是DNA,也可以是RNA;样本可以是纯化的,也可以是粗制的;可以是新鲜的,也可以是陈旧的;可以是完整的大片段DNA样本,也可以是部分降解的DNA。
第二节 PCR反应系统的组成
一、耐热DNA聚合酶(Taq酶)
二、引物
三、四种脱氧核糖核苷酸:dNTP
四、缓冲溶液
五、模板DNA
第三节影响PCR的主要因素
PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析。PCR自动热循环中影响因素很多,对不同的DNA样品,PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下: