分子克隆.doc

文档介绍：分子克隆实验常见问题与解决方案
黄荣桂
Fermentas China
Experie nee
■ Fermentas总部的技术支持经常接到克隆实验相关 问题的咨询（5・6例/周）
■我今天和大家介绍：
最常规的一些问题/原因/解决方案
时间安排
Pre pari ng vector and insert
—个经典的克隆实验一般不会超出
2-3天的时间
RE1
RE2
RE1 RE2
Ligation
RE1
o
• Day1:准备载体&插入子9连接 9转化
• Day 2:挑克隆9菌落PCR或者菌 液PCR检测阳性克隆T分离DNA 9限制酶消化或者测序分析
• （Day 3:从过夜培养的菌液中分离 DNA ,并通过限制酶消化分析or测 序）
Analysis: colony PCR
RE cleavage
Final Goal
•优化克隆流程可以让阳性克隆
>80%
选5克隆子9至少得到4个阳性克隆
克隆流程
■准备载体和待插入的DNA
-内切酶消化PCRj^物或者质粒
-DNA末端修饰
■胶回收
-DNA浓度的估算
■连接
-建立体系
■对照反应
■转化
■对照反应
Restriction digestion: PCR products
■问题：切割效率低
每种限制性内切酶需要一定的保护碱基
http:〃 /
Catalog (2010/11), page 171
Enzyme bp from the recognition site to fragment end
1 2 3 4 5
Csel
50-100
Csp6l
50-100
Dpnl
50-100
Dral 0 0-20 50-100
Eam1104l 0 50-100
EamllOBI 0 50-100
Ed136lT 50-100
0-20
50-100
0-20
20-50
50-100
Nsbl
Olil
Eco24l
Eco31l
Eco32l
50-100
20-50 50-100
20-50 50-100
Pae I
20-50
20-50
50-100
Pasl
50-100
50-100
A FA JAA
■A 丄 A/%
Restriction digestion: PCR products
FastDigest® poster
ONE unhrersal buffer for all digests temperature for all digests • ONE pl cuts 1 闻 of DNA ・ Complete digestion in 5-15 min
Enzyme
Specific rty
"J*
Reaction
-temp&rature,
°C
Lambda DNA
Pbamid DNA
PGR product Q»nomic
42|ig/3(M
liq/IOpI
RmWII—PJUti] FaetfiigMl* Ao:l pCml] Fastfit^MFAccGSI [sa^ FuWigMrAd I p*Epl40fi^ FastfiigM^ 回列 FMMgaatM'fel $847)1] FaatfiATd 仙阳q F&sffiigMTA^el 押叫 FuffiiTAjiJ 产 FMtMgMPAIeipQ FastDigest* Alu I faiffli-FAiwzn FNtfiig««PAI 御 FaafflignTAIwNI 耳 F8atDig«vt*Apal

G7 MKAD

C叫*
C1W6吨眄.

C TTU6
ACCGST
GKMN MiSTG
K Cl GW3CW C
GTCTCp^^.
GAGHFKCTG

37
37
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37
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37
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37
15
15
5
15
20
30
5
5
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60
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ID
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10
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