文档介绍：细胞因子对HSC mRNA表达的影响
【摘要】目的: 探讨细胞因子对核心蛋白聚糖(D) mRNA 表达的调节作用。方法: 以HSCT6细胞为研究靶细胞, 选择血小板衍生生长因子(PDGF)、 IFN、 TNFα和IL6, 通过RTPCR技术观察这些细胞因子对HSCT6细胞D mRNA表达的影响。结果: IFNγ在108~109 U/L浓度能抑制HSCT6细胞增殖和增加D mRNA 的表达, 而IFNγ在105~106 U/L浓度时使细胞D mRNA 的表达降低; TNFα在高浓度(50 nmol/L)能够使 D mRNA表达减少; PDGF在10 μg /L和100 mL/L FCS培养条件下作用最明显; IL6使HSCT6细胞D mRNA水平下调。结论: IFNγ和TNFα对D核心蛋白基因表达有双重调节作用, 这种调节作用发生在转录和转录后水平, PDGF对细胞增殖的调节与D 表达抑制相关。
【关键词】核心蛋白聚糖(D) TNFα IFNγ PDGF IL6
众所周知核心蛋白聚糖(decorin, D)具有抗组织纤维化作用, 而细胞因子在对抗纤维化的形成机制中表现出重要而复杂的作用[1, 2], 细胞因子是否能通过调节D的表达实现对抗肝纤维化的作用?其调节作用如何, 国内尚未见报道。我们通过RTPCR技术观察IFNγ、
TNFα、血小板衍生生长因子(PDGF)和IL6对HSCT6细胞D mRNA 表达的影响, 旨在从免疫学角度探索肝纤维化治疗的新途径。
1 材料和方法
材料
大鼠肝星形细胞株HSCT6细胞为Mount Sinai医学院Friedman教授惠赠。RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司。rhTNFα、rhIFNγ和 rhPDGFBB购自美国RD公司。RNA抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司。PCR扩增仪购自TECHNE公司。紫外凝胶成像分析系统型号VL为法国VILBER公司产品。
方法
细胞培养
HSCT6细胞50 mL/L CO2、 37℃孵箱中培养, RPMI1640含100 mL/L热灭活新生牛血清。×106~1×106, 每2~3 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。
细胞处理
取对数生长期细胞, 调整细胞密度为1×108/L, 接种于50 mL培养瓶, 5 mL/瓶。18~20 h换含10 mL/L FCS RPMI1640培养液, 继续培养20~24 h使细胞静止; 分组换液, 换含100 mL/L FCS RPMI1640 培养液, 同时加入不
同种类、不同浓度的细胞因子, 对照组只加培养基不加细胞因子。培养24 h后收集细胞并抽提总RNA。
总RNA抽提
用德国QIAGEN公司试剂盒抽提, 按说明进行操作。将细胞先用冷PBS洗涤、胰蛋白酶消化、收集, 然后抽提总RNA。对所得样品RNA经紫外分光光度仪进行浓度及纯度测定, -70℃保存。
RTPCR扩增
2 μg总RNA加入25 μL反转录体系中, 42℃ 1 h, 94℃ 3 min终止反应。 μL反转录产物加入PCR反应体系中, 在PCR仪中进行反应