文档介绍：荧光定量PCR技术原理及应用 REAL-TIME PCR
郭卫
武汉大学医学研究中心
复习普通PCR
RT-PCR
荧光探针杂交技术
PCR技术
荧光定量PCR
荧光
What is Real-Time PCR?
荧光实时定量PCR技术的产生
1992年由Higuchi等人第一次报告:使用EB加入PCR反应体系,D的PCR仪检测样品的荧光强度
核酸↔染料荧光
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I 取代 EB.
荧光探针杂交技术
What is Real-Time PCR?
What is Real-Time PCR?
所谓实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量和定性分析
在实时荧光定量PCR反应中,引入一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,产物不断积累,荧光信号强度也等比增加。通过检测荧光强度的变化,我们就可以得到荧光扩增曲线
cap
PCR vessel
thermal block
sample
What is real-time PCR?
Links an optical system to a thermal cycler
Signals captured at every reaction step
Direct electronic results
Quantitative or qualitative (.+/–) results
lens
①样品处理
③琼脂糖电泳
③PCR反应中
实时检测
④EB染色
④自动
数据分析
②荧光染料
②常规PCR
⑤
⑥人工
数据分析
荧光定量PCR与普通PCR的比较
Other benefits…
Real-time PCR is an EXACT science!!
Variables must be minimised to achieve the necessary precision!
Rapid analysis (typically in under 90 min)
No post-PCR processing (no gels or autoradiographs)
Automated (data collection and analysis)
Objective analysis (controls & standards can be built-in)
Precise, sensitive and reproducible
Unprecedented dynamic range – up to 12 orders
如何定量?