文档介绍：酵母发酵生产核糖核酸实验三酵母核糖核酸的提取及测定(实验报告)
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实验选材上需把握以下几个原则:(1)材料所含分离纯化的目标物要丰富;(2)材料要容易获得;(3)由该材料所设计出的分离纯化方法要简便可行且适于工业化大规模流水线生产;(4)综合成本要降到最低,以谋求最大利润。
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目前工业上常用的提取RNA的方法有浓盐法和稀碱法,两种方法各有特点:浓盐法的破壁率低,但提取的RNA纯度比稀碱法要高;稀碱法的破壁效果好,消耗时间短,能耗低,但提取RNA纯度较低(碱性条件下RNA易被水解),适于工业化生产。[4]因为工业生产需要综合考虑效率、成本等问题使利益最大化,不需要高纯度的RNA制品,故多采用稀碱法;而学生实验旨在培养学生的技能,且在实验室相对成本而言对产品的纯度更为看重,故本实验选用浓盐法。
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RNA是***物质,在等电点时溶液中因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,故溶解度最低。~,DNA等电点为4~,,一方面使RNA较多地沉淀下来,另一方面由于拉大了与DNA等电点的差距,使得在该pH下杂质DNA较多溶解在溶液里,且会发生水解。此外,蛋白质也会在溶液中有一定的溶解度。该步操作既分离得到了RNA,又一步除去了相当多的杂质,使效益达到了最大化,是最主要的纯化步骤。
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DNA的去除有以下几个考虑:(1)由于核膜内的DNA分子量较大,穿越膜孔较困难,一般不易释放到菌体外面,离心后可随母体残渣一起除去;(2)10%的NaCl溶液中DNA溶解度很小,大部分以沉淀形式存在于溶液中,离心后也会除去;(3),DNA溶解于溶液中,RNA沉淀出来,再次对DNA进行了去除。
?厂家是如何考虑的?
乙醇属于易燃品,乙醇泄露有可能引发火灾甚至爆炸,所以工业上大量的乙醇洗涤是存在安全隐患的。
在实际工业生产中,厂家需要优先考虑的是生产成本及效益。首先,乙醇是一种廉价但又非常好的溶剂,它可以溶解许多的无机物及多种有机物,用它作为洗涤剂来去除RNA样品上含有的无机盐(NaCl)和一些脂溶性杂质是再合适不过了;其次,乙醇易挥发,用其洗涤后的RNA沉淀不需要非常繁杂的干燥程序,风干即可;再者,乙醇还具有消毒的作用,洗涤后的产品不易受微生物的侵染而变质***,延长了保质期;最后,乙醇使用过程中只要采用合理的管理与监测手段(如乙醇报警器等),是可以避免危险发生的。综合以上各点,只要前期投入一部分资金用于乙醇使用时的检测与管理,后期工业生产中便会带来巨大的经济效益,所以明智的厂家当然还会选择乙醇洗涤沉淀。
,为什么要固定溶液的pH值?若pH值不固定会影响测定结果吗?为什么?
在测定RNA含量之前需用2%。这样做的原因有以下几个:(1)核酸在过酸或者过碱条件下,双螺旋区会发生氢键断裂,紫外吸收升高,这种现象称为增色效应。此外在不同pH溶液中,嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同,紫外吸收也随之表现出明显的差异。而紫外法通过测定OD260值来计算RNA含量,因此需要排出相关变量对紫外吸收的影响。(2)核酸的摩尔消光系数(比消光系数)ε(ρ)并不是一个确定的值,而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化,其经典数值均是在pH = ,。(3),使核酸样品尽可能多的溶解,测定结果更准确(次要原因)。
pH值不固定肯定会影响到测定结果的准确性,原因上文已经分析。
,加入钼酸铵-过***酸沉淀剂的作用是什么?离心除去沉淀后,其上清液为什么需要稀释100倍?
加入沉淀剂的目的是使B管的RNA全部沉淀下来,离心后用其上清液作为空白管调节仪器100%T,再测定A管RNA浓度,从而排除测定体系中除了特异性光吸收本体物质(RNA)之外的其他物质对溶液光吸收的影响。
测定前将溶液稀释100倍的原因是:(1)使吸光度值落在朗伯-比尔范围内(~),在该范围内吸光度与RNA浓度呈较好的线性关系,测定结果也更加准确。(2)减弱甚至消除过量的沉淀剂对吸光度的影响。B管同样稀释了100倍,B管与A管相比,溶液中除了相差RNA之外,还有可