文档介绍：“从RNA 提取到荧光定量PCR”解决方案
――qPCRqPCRqPCR系统系统
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
市场部郭正霞
内容概要
荧光定量PCR 的原理
荧光定量PCR 的标记方法
荧光定量PCR 解析方法
SYBR 法实验流程及注意事项
TIANGEN 公司荧光定量产品选择指南
荧光定量PCR 原理--定义
实时定量PCR 技术:
利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩
增产物量的变化,通过Ct 值和标准曲线的关系对起始模板进
行定量分析
与常规 PCR 技术比较:
对PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析,无法对起始模
板准确定量,无法对扩增反应实时检测
荧光定量PCR 原理--常用名词概念
扩增曲线
荧光阈值
Ct 值
荧光定量PCR 原理--扩增曲线
平台期
) )
荧光基团) )
荧光强度荧光强度
荧光强度荧光强度
( (
( (
Rn
Lg ---liner phase
Baseline
(((循环数(循环数)))
荧光检测元件 Cycle
荧光定量PCR 原理--荧光阈值
前15 个循环信号作为荧光
平台期
) )
本底信号(baseline ) ) )
荧光阈值的缺省设置是
荧光强度荧光强度
荧光强度荧光强度
( (
3~15 个循环的荧光信号的标( (
准偏差的10 倍 Rn
Lg ---liner phase
手动设置:大于荧光背景 Threshold
值和阴性对照的荧光最高
值;进入指数期的最初阶段
真正的信号:荧光信号超
过阈值 Baseline
Cycle (((循环数(循环数)))
荧光定量PCR 原理--CtCtCt值Ct 值
) )
) )
荧光强度荧光强度
荧光强度荧光强度
( (
Ct 值的定义: ( (
Rn
PCR 扩增过程中,扩 Ct value
增产物的荧光信号达到
设定的阈值时所经过的
扩增循环次数
Cycle (((循环数(循环数)))
Ct 值的重现性
纵轴纵轴
纵轴纵轴
: :
: :
荧光信号量荧光信号量
荧光信号量荧光信号量
横轴:::PCR 反映循环数
CtCtCt值的特点Ct 值的特点:
相同模板进行96 次扩增,终点处产物量不恒定;
Ct 值极具重现性
荧光定量PCR 原理--CtCtCt值定量的数学原理Ct 值定量的数学原理
理想的PCR 反应= n
Xn X0 * 2
n::扩增循环数扩增循环数
::起始模板数量起始模板数量
X0
::第第次循环后扩增产物数量
Xn n
荧光定量PCR 原理--CtCtCt值定量的数学原理Ct 值定量的数学原理
非理想的PCR 反应
= ( + )n
Xn X0 * 1 En
n::扩增循环数扩增循环数
En ::扩增效率扩增效率
::起始模板数量起始模板数量
X0
::第第次循环后扩增产物数量
Xn n